SK-N-BE(2) 세포주에서의 Insulin에 의한 serum-deprivation시의 세포 사멸의 촉진에 관한 연구

Abstract

Growth factors which have tyrosine kinase receptors such as insulin, EGF, and NGF were known to suppress the cell death mediated by serum deprivation in a number of cell lines via the activation of phosphatidyl inositol 3' -kinase.. Moreover, it has been demonstrated that cell/extracellular matrix interaction was important to prevent cell death in a number of anchorage dependent cell types. However insulin enhances the cell death induced by serum deprivation in SK-N-BE(2) human neuroblastoma cell line eventhough PI3-K activated by insulin treatment. To address role of the insulin on this cell death and that this type of cell death is a typical apoptosis we examined morphological and biochemical changes during the cell death induced by serum deprivation and compared with those in the cell death induced by heat shock. To understand why insulin accelerates the cell death, we studied metalloprotease activity because we observed cells treated with insulin easily detached from substatum. Metalloprotease activity in medium was increased by insulin. We examined morphological changes together with oligosomal DNA fragmentation and poly(ADP-ribose) polymerase proteolysis to address whether this insulin-mediated cell death is apoptosis. The oligosomal DNA fragmentation pattern was almost identical whether insulin was present or not when cells were incubated in serum-free media. However, PARP cleavage was stimulated by insulin. Although chromatin condensation was observed, nuclei were maintained intact in the presence of insulin. These results suggest that the loss of cell/matrix interaction by the insulin-mediated activation of metalloprotease is a part of the reason for the acceleration of cell death. Moreover, the cell death enhanced by insulin was different with typical apoptosis.;많은 세포에 있어서 serum-deprivation에 의해 유도되는 apoptosis는 인슐린, NGF, EGF와 같은 growth factor에 의해 억제될 수 있으며, 이는 PI3-kinase/Akt를 경유한 신호전달에 의한다고 보고되어있다. SK-N-BE(2) neuroblastoma 세포는 growth factor에 의해 PI3-kinase는 활성화 시킬 수 있으나, Ras를 통한 신호전달 기작에는 이상이 있는 세포로 growth factor에 의해 분화되지 않는 특징을 보이는 세포이다. 이런 BE(2) 세포에서 serum-deprivation시 인슐린을 처리한 결과 오히려 세포 사멸을 촉진 시켰으며, 인슐린에 의해 촉진되는 세포사멸을 분석하기 위해 heat shock에 의해 유도 되는 세포사멸과 형태적, 생화학적으로 비교 분석하였다. 인슐린에 의해 촉진되는 세포사멸시 apoptosis의 특징인 DNA fragmentation, 염색질의 응축(chromatin condensation), PARP proteolysis는 유도되었으나, 막의 돌출(membrane blebbing), 세포질의 응측(cytoplasmic condensation), 핵의 단편화(nuclei cleavage)등은 관찰할 수 없었다. 또한 serum-deprivation에 의해 유도된 DNA fragmentation은 인슐린에 의해 더 촉진되지는 않았으나, PARP proteolysis는 더 촉진됨이 관찰되었다. 이는 전형적인 apoptosis의 특징과는 다른 것으로 생각되며, 이러한 세포사멸에 BE(2) 세포의 신호전달기작의 이상에 의해 전형적인 apoptosis가 유도될 수 없어서인지, 아니면 인슐린에 의한 세포사멸이 전형적인 apoptosis와는 다른 형태의 세포사멸인지 알아보기 위하여 heat shock에 의한 세포사멸을 분석하여 보았다. 그 결과 heat shock에 의한 세포사멸은 전형적인 apoptosis의 특징을 보이며, 이로써 인슐린에 의해 유도되는 세포사멸은 heat shock에 의해 유도되는 전형적인 apoptosis와는 다른 형태의 세포사멸임을 시사한다. 또한 zymography에 의해 인슐린을 처리한 세포의 배양액에서 metalloprotease의 activity가 더 촉진됨을 관찰함으로써, 이는 인슐린에 의해 촉진되는 세포사멸의 원인중의 하나가 인슐린이 세포배양액 내에 metalloprotease의 activity를 증가시켜 세포와 ECM과의 작용을 억제시키기 때문일 가능성을 시사한다.