Cellulomonas속 세균의 원형질체 형성과 전자현미경적 연구

Abstract

In order to develope a protoplast fusion of the genus Cellulomonas having high assimilibility of cellulose, the optimum conditions for the formation and regeneration of protoplast of Cellulomonas sp. CS1-1 and Cellulmonas flavigena NCIB 12901 were investigated and observed under SEM. The rate of protoplast formation was 99.9% (CS1-1) or 80% (C. flavigena) under the following conditions; osmotic stabilizer : 0.5 M sucrose, culture time : late exponential growth phase, Temperature : 30˚C, pH 7.0, concentration of lysozyme: 100 ㎍/ml (CS1-1) or 600 ㎍/ml (C. flavigena), treating period : 30 min. (CS1-1) or 6 hrs. (C.flavigena). The rate of protoplast formation of C. flavigena was lower than that of CS1-1, the same genus Cellulomonas in spite of higher concentration and longer treating period of lysozyme than those of CS1-1. The effect of culture time of cells on protoplast formation of CS1-1 was same, when the cells were harvested at mid and late exponential growth phase. However, the rate of protoplast formation of C. flavigena was sensitive to the culture time. When C. flavigena was treated in the same method, the cells harvested at mid exponential growth phase, protoplasts were more efficiently formed than harvested at late exponential growth phase. So, the rate of protoplast formation of C. flavigena was 95%, when C. flavigena at mid exponential growth phase was treated with lysozyme 400 ㎍/ml for 6 hours. When the protoplast of C. flavigena was counted by means of the indirect counting method in plate after osmotic shock treatment, the rate was considerably higher with the cells of the late exponential growth phase. When the protoplast of the cells above mentioned was observed under SEM, it was observed that the formation of protoplast was not enough. In the qualitative and quantitative evaluation of protoplast formation, the direct method of the observation under SEM was much more believable than the indirect method of counting numbers of protoplasts in plate. Because of the distinction between spheroplasts, and protoplasts was impossible in the counting numbers of protoplasts. The regeneration frequency of protoplasts was sensitive to the concentrations of lysozyme treated to the cells. As the higher concentrations of lysozyme were treated, the regeneration frequency of protoplasts was more decreased. The proper concentrations of osmotic stabilizers used for regeneration medium were 0.4M and 0.5M. Under this concentrations, regeneration frequency of protoplasts of CS1-1 was about 10-12%.;Cellulose분해력이 높은 Cellulomonas 속 세균 Cellulomonas sp. CSI-1과 Cellulomonas flavigena NCIB 12901의 원형질체의 융합을 위한 원형질체의 형성조건과 재생에 대하여 조사하였고 SEM으로 사진 촬영하여 원형질체 형성과정을 추적하였다. 각 균주를 대수증식기 말기까지 배양하여 osmotic stabilizer로써 0.5M sucrose를 함유한 pH 7의 고장용액에 현탁시킨 후 lysozyme 농도(10㎍, 30㎍, 50㎍, 100㎍/㎖) 및 효소처리 시간(15분, 30분, 60분)을 조사해 본 결과 CSl-1균주는 lysozyme 100㎍/㎖로 30℃에서 30분간 정치배양하였을 때 99.9%의 높은 형성율로 거의 모두가 원형질체화 되었으며 같은 Cellulomonas속 일지라도 C. flavigena 경우에는 lysozyme농도(300㎍, 400㎍, 500㎍, 600㎍/㎖) 및 효소처리시간(2시간, 5시간, 6시간)를 조사해 본 결과 이보다 높은 농도인 600㎍/㎖ 의 lysozyme으로 30℃에서 6시간 처리하여 전자현미경으로 관찰하였을 때 약 80%의 형성율을 보였다. 배양기간이 원형질체화에 미치는 영향은 CSI-1균주는 lysozyme 100㎍/㎖로 30분간 처리하였을때 대수증식기 중기, 말기 모두 95%이상의 비슷한 형성율을 나타내어 배양기간에 큰 영향을 받지 않음을 보였으나 C. flavigena경우에는 lysozyme 400㎍/㎖로 2시간 처리하였을때 같은 처리조건일지라도 대수증식기 말기에서보다 중기에서 원형질체화가 잘 이루어지는 것을 보여 배양기간에 상당히 민감한 반응을 나타냈으며 대수증식기 중기에서 lysozyme 400㎍/㎖로 6시간처리하여 95%이상이 원형질체화되는 것을 볼 수 있었다. 원형질체의 형성확인법으로는 원형질체 계수법에 의한 간접적인 방법은 spheroplast의 형성과 원형질체의 형성이 구별되어 지지 않으므로 그 결과가 전자현미경상으로 직접 관찰하는 결과와 일치되지 않는 경우가 있으므로 전자현미경으로의 관찰이 뒤따라야 하는 것을 알 수 있었다. 원형질체의 재생은 원형질체 형성시에 사용되어진 lysozyme의 농도에 크게 영향을 받아 처리된 농도가 50㎍/㎖인 원형질체가 재생율이 10%정도로 100㎍/㎖ 처리된 원형질체의 재생율 약 5%에 비해 두배의 재생능을 보였으며 재생용 배지의 osmotic stabilizer,로 sucrose, D-sorbitol, mannitol, 3종류를 농도 0.3M, 0.4M, 0.5M, 0.6M로 검토한 결과 0.4M과 0.5M의 stabi1izer에서 10-12%의 재생율을 보였다.