알칼리성 Bacillus sp. 8-13으로 부터 제한효소의 분리정제 및 특성

Abstract

Tirty-one bacterial strains were examined for the presence of type Ⅱ restriction endonuclease in aerobic culture. Two strains were found to contain specific enzymes ; Pseudomonas syringae pv. phaseolicola and Bacillus sp. 8-13. Among these, a restriction endonuclease from Bacillus sp. 8-13 was investigated. The characteristics of this microorganism is the ability to grow well in alkalophilic and high temperature condition, that is at pH, 10.3 and 50℃. This strain is similar to Bacillus alkalophilus subsp. halodurans if morphological, physiological and biochemical characteristics were compared. The endonuclease was stable at wide range of pH (pH 8.0 - 12.0), high salt (up to 100 mM) and high temperature (up to 50℃). The enzyme was purified from crude extract by streptomycin sulfate, ammonium sulfate precipitation, which was followed by DEAE-cellulose and phosphocellulose ion exchange column chromatography, and the subunit molecular weight was about 32,000 daltons by polyacrylamide gel electrophoresis containing 0.1 % SDS. This enzyme digests plasmid pBR322, pUC18, M13mp18 DNA and bacteriophage lamda DNA. The restriction map of pUC18 DNA with this enzyme was studied and founded that the endoenzyme cleaves the same recognition site of Asu I from Anubuena subcylindricu. And now the specific recognition and cleavage site is under the investigation using the dideoxy chain termination sequencing method.;약30여가지의 균주를 대상으로 제한효소의 유무를 조사하여 Pseudomonas syringae pv. phaseolicola와 Bacillus sp.8-13으로 부터 제한효소의 활성을 발견할 수 있었다. 그 중 알칼리 환경에서 잘 적응하는 Bacillus sp. 8-13으로 부터 생산되는 제한효소를 분리하여 그 특성을 조사 하였으며, 이 균주의 형태적, 배양학적, 생리적 특성을 조사한 결과 Bacillus sp. 8-13 균주는 Bacillus alkalophilus subsp. halodurans 와 매우 유사하였다. 이 균주의 최적 생육 pH는 10.3 이었고, 최적 증식 온도는 50℃이었다. 이 균주의 제한효소를 Streptomycin sulfate 침전, Ammonium sulfate 침전, DEAE-cellulose 와 phosphocellulose ion exchange column chromatography 과정을 통해 정제하였고, 0.1% SDS를 포함하는 polyacrylamide gel electrophoresis 로 subunit 의 분자량을 조사한 결과 약 32,000 dalton 이었다. 이 효소는 또한, pH 8부터 12의 알칼리 pH 범위에서 안정하였고, 50℃까지 활성이 유지되었으며, 높은 염농도에서도 저해되지 않았다. 그리고 플라스미드인 pBR 322 와 pUC18, M13mp18 등과 박테리오파지 lamda DNA를 절단할 수 있었다. 이 중 pUC18 DNA를 이용하여 제한효소의 지도를 작성하였다. 이 제한효소는 -GGNCC-를 인식하는 Asu Ⅰ 등과 유사 하였으므로 이를 확인하기 위하여 이 제한효소의 인식서열을 포함하는 DNA의 작은 조각을 이용하여 그 인식서열을 확인하는 연구를 진행 중이다.