금속 화합물을 사용한 DNA 절단반응 및 반응 메카니즘에 대한 연구

Abstract

본 연구에서는 금속 화합물들이 DNA와 반응하여 DNA 절단을 일으키는 현상을 관찰하였다. DNA 절단 반응에 관여하는 화합물은 서열 선택성이 있는 절단을 할 경우 DNA footprinting과 3차원적 구조 분석의 탐침자로서 이용될 수 있다. 또한 가수분해로 DNA 절단을 일으키는 화합물은 인공 제한 효소의 재발에 기여하고 있으며 DNA를 공격하여 암세포 증식을 막는 작용을 하는 화합물로서 항암제로의 개발이 귀추되고 있다. Nickel complex는 oligonucleotide의 배열에서 guanine에만 modification을 하는 효율적인 금속 화합물이다. 또한 이 화합물은 olefin epoxidation 반응을 시키고 oligonucleotide oxidation도 일으키는데, 이 반응의 선택성은 complex의 리간드에 따라 반응성이 달라진다. 본 연구에서는 여러 nickel complex를 산화제 존재하에 plasmid DNA와 반응시켜 그 반응성을 조사하였다. 리간드가 다른 nickel complex들을 DNA와 반응시켜 본 결과 화합물의 종류마다 DNA 절단 반응성이 다르게 관찰되었다. 또한 산화제 존재 하에서 cobalt nitrate를 plasmid DNA와 반응시킨 결과 산화제 농도가 높을수록 DNA 절단 반응이 증가하였고, 다른 금속(Fe, Ni, Cu, Zn) 이온과 비교한 결과 이러한 절단 반응은 Co^(2+)에서만 특이하게 관찰되었다. 금속 포르피린은 생체내 물질을 광화학적 방법으로 손상시키며, 종양 세포에 대한 높은 친화도를 나타내는 화합물이다. 본 연구에서는 여러 철-포르피린의 DNA에 대한 반응성을 조사하고 그 반응종을 알기 위해 여러 조건에서 반응성을 관찰하였다 철-포르피린 Fe(TF_(4)TMAP)^(5+), [meso-5,10,15,20-tetra (2,3,5,6- tetrafluoro-4-N,N,N-tri-methylammonium-methylphenyl)porphine](iron(III))는 산화제 존재하에서 DNA 절단을 일으켰다. Radical quenching 실험 결과 반응종이 라디칼이 아님을 밝힐 수 있었고, pH 실험 결과 가장 산성인 pH에서 반응성이 가장 높은 것으로 나타났다. 이 결과들로 반응종은 고-산화 철 옥소 화합물이라고 추정할 수 있었다. Fe(TMPyP)는 산화제의 도움없이 DNA 절단을 일으키는 것으로 나타났다. 이 화합물의 절단 반응 메카니즘을 이해하기 위해 radical quenching 효과, dithiothreitol 영향, 산소 제거 실험, 그리고 절단된 DNA에 ligase 처리 실험을 하였다. 이와 같은 실험 결과 Fe(TMPyP)와 DNA 반응은 라디칼 반응이 아니고 가수분해에 의한 반응으로 판단되었다. 또한 이 화합물의 DNA 서열 선택성을 확인한 결과 guanine을 선택적으로 절단하는 것을 관찰하였다.;DNA strand scissions are of considerable interest both in understanding the ubiquitous phosphate ester hydrolysis reactions carried out in nature and in designing new artificial restriction enzymes. In our approach to understand the metal-mediated DNA modifications, we carried out various metal complex reactions with DNA. The reactive intermediates and the mechanistic aspects of these reactions were investigated by correlating our studies with the olefin epoxidation experiments undertaken by the Bio-Inorganic lab in the Department of Chemistry. Our studies included reactions of DNA cleavage, using the systems of cobalt salt and KHSO_(5), nickel complex and KHSO_(5), and iron(Ⅲ) porphyrin complexes in the presence and absence of oxidants. Cobalt nitrate activity in the presence of KHSO_(5) resulted in an efficient cleavage of plasmid DNA. Other metal salts were tested and proved to be inactive in DNA modification. From the results of olefin epoxidations by the Co^(2+)/KHSO_(5) system, such as the cis-stilbene oxide being produced as the major epoxidation isomer, we proposed that the cobalt oxo species and cobalt-HSO_(5) complex are both possible intermediates for the oxidative modification of DNA and olefins. Nickel complexes are reported to induce guanine-specific modifications of oligonucleotides. We studied the ligand effects of the nickel macrocyclic complexes in oxidative DNA modifications. In our studies, nickel complexes induced DNA cleavage in the presence of an oxidant, in which its reactivity varied according to its structure. Factors such as Ni(Ⅲ) redox potential, vacant coordination site of Ni, and complex flexibility are reported to be the affecting factors. Iron(Ⅲ) Porphyrin complexes were also studied. [Fe(TF_(4)TMAP)^(5+)] was found to induce DNA cleavage In the presence of an oxidant. Radical quenchers did not inhibit the cleavage reactions, suggesting that radicals are not the reactive species. These results were correlated with the olefin epoxidation results, which showed evidence that high-valent iron oxo porphyrin complex might be the reactive species. Many enzymes which carry out nucleophilic displacement reactions on phosphate esters require metal cations for reactivity. In our effort to understand the phophate esterifications by metal complexes, we studied the mechanistic aspects of DNA cleavage by Fe(TMPyP), which induces DNA cleavage without the presence of all oxidant. Our results showed that radicals were not the reactive species and that at least a partial amount of the cleavages were by hydrolytic reactions. These results indicate the possibility of identifying a metal reagent which effects DNA cleavage via a hydrolytic mechanism.