Streptomyces lavendulae EMS4가 생산하는 penicillium cyclopium 생장저해물질의 분리 정제

Abstract

본 연구의 목적은 진균의 세포벽 합성 저해 물질을 생산하는 방선균을 선별하고 대량생산을 통하여 항진균 물질의 분리 정제 과정을 확립하고 구조 규명을 위한 기반을 마련하는 것이다. Penicillium cyclopium의 균사 형태 이상을 일으켜 생장을 저해하는 물질을 생산하는 토양 방선균 분리주 EMS4를 선별하여 화학 동정 및 TAXON program을 이용한 수리 동정을 통해 균의 분류학적 위치를 확인하는 한편, EMS4가 생산하는 항진균 물질의 분리 정제를 시도하였다. 분리균 EMS4는 rectiflexible한 포자사슬과 표면이 smooth한 원기둥 모양의 포자를 가지며 세포벽의 peptide는 L-DAP와 glycine으로 연결되어 있는 peptidoglycan type A3γ이며 wall chemotype Ⅰ이고 세포벽내 당은 특정당이 나타나지 않는 sugar pattern C에 해당하므로 전형적인 Streptomyces sp.에 속함을 알 수 있다. 종수준의 동정을 위해 50가지 분류 단위형질을 조사하여 TAXON program을 이용 분석하여 수리동정한 결과, 주군집 61의 S. katrae가 S_(SM) coefficient 76%인 best match strain으로 나타났으나 이는 S. lavendulae와 synonym이므로 EMS4는 S. lavendulae EMS4로 동정되었다. S. lavendulae EMS4가 생산하는 항진균 물질의 발효특성 및 생합성 최적 조건을 조사한 결과 항진균 물질의 생성은 growth associated type이었으며 탄소원으로는 1% glucose, 질소원으로는 0.3% yeast extract, 0.5% tryptone, 무기염은 2.5mM이 가장 적합하였다. 항진균 물질의 분리 정제는 butanol추출, 1차 및 silica gel column chromatogrphy, preparative TLC 등을 통해 수행하였고 여기서 얻은 활성물질(EMS4-1)은 열과 pH에 대해 비교적 안정하였으며, Aspergillus sp.를 제외한 대부분의 진균과 Bacillus sp., Micrococcus luteus등의 세균에 항균력을 보였다. 이 물질(EMS4-1)을 preparative HPLC에서 Hypersil-ODS column에 loading하여 80% methanol로 용출시킨 결과 항균활성을 지닌 4가지 물질로 구성되어 있음을 알 수 있었다. 그러나 각 물질은 아직 다른 여러 불순물과 섞여 있는 것으로 보이므로 그 구조를 밝히고 신규물질인지의 여부를 확인하기 위해서는 앞으로 한 단계 이상의 정제과정이 더 수행되어져야 하겠다.;The aim of the present research program was to develop a strain of actinomycetes producing inhibitor of fungal cell wall biosynthesis. A number of actinomycetes were isolated from soil and a strain(EMS4) producing antibiotic against Penicillium cyclopium was selected. The isolate(EMS4) produced inhibitor of fungal cell wall biosynthesis, which caused swelling of P. cyclopium. The isolate was identified to be a member of Streptomyces lavendulae by numerical analysis using TAXON program. The production of antibiotics was related to mycelial growth and was affected by medium composition. Glucose and yeast extract were proved to be good carbon source and nitrogen source, respectively. The production of antibiotics was high at 1% glucose, 0.3% yeast extract, 0.5% tryptone and 2.5 mM inorganic phosphate. The antifungal antibiotics from culture broth of Streptomyces lavendulae EMS4 were isolated and purified by butanol extraction, 1st silica gel column chromatography, 2nd silica gel column chromatography, preparative TLC, and preparative HPLC using Hypersil-ODS column. The antibiotics(EMS4-1) were stable at 100℃ for 2 hours and in acidic or alkaline condition. EMS4-1 had antimicrobial activity against Bacillus subtilis, B. cereus, Streptomyces murinus, Micrococcus luteus and almost fungi but Aspergillus species.