소 dopamine β-hydroxylase(DBH)유전자 클로닝과 5'flanking부위의 염기서열분석

Abstract

진핵 세포내의 유전자 발현은 대부분의 경우 전사속도 변화가 그 기전이며 따라서 분자적 수준에서 upstream 부위에 존재하여 유전자 발현 변화를 매개하는 각 조절 반응 인자의 위치결정과 그 기능의 확인, DNA 결합 단백질의 성격 규명을 필요로 한다. 이에 소 dopamine β- hydroxylase(DBH) 유전자 발현 조절의 근간을 이루는 분자적 기전을 이해하기 위해 소 DBH 로 부터 몇개의 genomic clone을 분리해 냈다. 분리해 낸 genomic clone중 clone #2는 5'upstream 부위를 가장 많이 포함하고 있었다. 좀 더 5'upstream 부위의 특징을 규명하고자 clone #2를 subcloning(6.5Kb) 하고 6.5Kb에 대한 restriction map을 작성했다. Restriction map을 기초로 하여 소 DBH 유전자의 5'-flanking 부위를 포함하는 2.2Kb DNA를 분리해 내고 염기서열에 의해 분석했다. 2.2Kb DNA는 번역개시 부위를 포함하여 2216bp가 되며 DBH mRNA 5'의 1761bp에 해당한다. 전사개시 부위 가까이에서 전사 조절인자인 TATA box와 CAAT와 유사한 염기서열을 발견하였을 뿐만 아니라 1761bp내에서 CRE, TRE, SPI, AP2와 다른 조절인자 결합부위를 확인하였다. 또한 번역 개시부위 이후 325bp에서 intron을 발견하였다. 그러나, 염기 분석결과 나타난 조절인자들과 활성제에 의해 나타난 mRNA 수준이 일치하지 않는 것이 음성적으로 조절하는 인자나 발견된 인자외 다른 인자가 반응을 매개할 가능성을 포함하고 있어서 앞으로 이 인자들이 기능이 있는 지에 대한 연구와 다른 인자들의 확인이 요구되어지며 이러한 upstream 부위의 염기서열 분석과 조절인자들의 기능 분석은 DBH 유전자 발현조절에 있어서 분자적 접근을 더 용이하게 해 줄 것이다.;Delineation of the molecular mechanism of gene expression would require identification of the regulating DNA elements in the gene and characterization of the nuclear binding proteins. To better understand the molecular mechanism underlying regulation of gene expression of bovine dopamine β - hydroxylase(DBH), we have isolated several genomic clones for bovine DBH. Of the genomic clones, clone #2 containing the largest 5' upstream region was further subcloned and detailed restriction mapping analysis was carried out. Based on this restriction map, we isolated a 2.2Kb fragment (1.6kb, 600bp) containing the 5'-flanking region of bovine DBH gene and analyzed it by sequencing. This region was found to contain 2216bp including translation initiation site, and 1761bp of the 5' end of the DBH mRNA. We found possible transcription regulatory elements, TATA and CCAAT like sequences near the transcription initiation site of DBH gene. Cyclic response element(CRE), TPA response element(TRE) and other regulatory elements binding site were also observed. We identified the exon-intron junctions, downstream of transcription initiation, at 325bp, by published bovine cDNA sequence. But in this region 3' consensus sequence of intron was not found. Sequence analysis of this upstream region and functional analysis of the elememts will provide insight into the molecular mechanism of the regulation of DBH expression.