Arthrobacter simplex IAM 1660로부터 steroid △1-dehydrogenase유전자의 클로닝

Abstract

Arthrobacter simplex has the prominent steroid Δ^(1)-dehydrogenase activity which introduces 1,2 double bond into steroid ring A and has been used in the production of corticoid drugs. In this study in order to perform the genetic work for Δ^(1)-dehydrogenase, the cloning of Δ^(1)-dehydrogenase gene from Arthrobacter simplex IAM 1660 was attempted. The constructed genomic library using λgtll expression vector was immunoscreened with Δ^(1) -dehydrogenase antiserum. Finally, one positive clone was isolated by primary, secondary, tertiary screening and identified to carry the 1.6kb EcoR I insert DNA fragment. For stability of insert fragment, the 1.6kb EcoR I insert DNA fragment was introduced into 2.75kb EcoR I cut-pBS vector. Restriction mapping showed that one Kpn I and PstI site were located, but no restriction site for BamH I , HindⅢ, Pvu I , Sfu I , XbaI, XhoI, EcoRI was found. The only portion of 1.6kb inseirt DNA fragment was subcloned into pBS vector and attempted to express in E. coli DH5α by induction with IPTG. However, the expression of the cloned genes in E. coli cells was not yet identified by western blot analysis.;각종 스테로이드 분해능을 가지는 Arthrobacter simplex는 스테로이드 A 환의 탄소 1,2 위치에 이중결합을 도입하는 △^(1)-dehydrogenase 활성이 매우 뛰어나 산업적으로 corticoid 약물 제조에 이용되어 온 중요한 균주이다. 본 연구에서는 △^(1)_dehydrogenase에 관한 유전학적 연구를 수행하기 위하여 Arthrobacter simplex IAM 1660으로부터 유전자의 클로닝을 시도하였다. λgt11 발현 벡터에 의해 제조된 Arthrobacter simplex의 genomic library로부터 이미 본 실험실에서 정제한 △^(1)-dehyogenase를 토끼에 주입하여 생성시킨 항혈청을 이용하여 immunoscreening 방법으로 항체와 반응을 보이는 양성 클론을 선별하였다. 1차, 2차, 3차 screening 과정을 거쳐 최종적으로 1 개의 양성 클론을 순수분리하였고 약 1.6kb의 insert DNA를 포함하고 있음을 확인하였다. λgt11내에서 insert fragment의 안정성이 유지되지 않는 문제점을 해결하기 위해 insert fragment를 pBS vector로 옮겼다. Restriction mapping에 의해 1.6kb insert DNA에는 PstⅠ, KpnⅠ site는 한 개씩 있으나 BamHⅠ, HindⅢ, PvuⅠ, SfuⅠ, XbaⅠ, XhoⅠ, EcoRⅠ에 대한 site는 없는 것으로 확인되었다. 1.6kb insert DNA에 대한 제한 효소 지도를 토대로 하여 삽입절편의 일부분만을 포함하는 subclones을 만들었고 DNA의 발현여부와 항체와의 반응부위를 알기 위해 각각의 subclones을 Ε. coli DH5α내로 도입한 후 IPTG 침가에 의해 클론된 유전자의 발현을 유도하였으며 Western blot 등을 통해 항체와의 반응성을 확인함으로서 발현여부를 확인하고자 하였으나 항혈청내의 Ε. coli와 반응하여 양성으로 인지되는 단백질들이 많아 발현 여부를 확인하기가 어려웠다.