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Streptomyces willmorei EMP22가 생성하는 cryptococcus laurentii에 대한 항진균물질의 검색 및 분리정제

Title
Streptomyces willmorei EMP22가 생성하는 cryptococcus laurentii에 대한 항진균물질의 검색 및 분리정제
Other Titles
Screening and Purification of Antifungal Antibiotics against Cryptococcus laurentii produced by Streptomyces willmorei EMP22
Authors
朴貞姬
Issue Date
1995
Department/Major
대학원 생물과학과
Keywords
Streptomyces willmorei EMP22cryptococcus laurentii항진균물질
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Abstract
본 연구는 토양으로부터 방선균을 분리하여 이중 항진균성 항생물질을 생산하는 방선균을 검색, 선별하고 그 항생물질을 분리하고자 하는데 목적이 있다. 본 연구의 중요성에 관해 말하면 본 연구는 방선균으로부터 진균의 cell wall에 작용하는 항생물질의 분리를 목적으로 하고 있는데, 진균의 cell wall은 β-1, 3-glucan, chitin, mannan등의 polysaccharides로 구성되며, 이 cell wall은 진균의 생장에는 필수적이고 동물세포에는 존재하지 않는다. 따라서 진균의 cell wall 합성을 억제하는 inhibitors는 안전하고 효과적인 항진균 물질이다. 이와같은 항진균 물질은 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다는 점에서 본 연구 - 항진균물질의 분리는 중요성을 가진다. 다양한 토양시료로부터 방선균 선택배지인 chitin agar 배지를 사용하여 513균주를 분리하였고, 1차 2차 screening과정을 통해 여러 진균에 대해 항진균성 항생물질을 생산하는 방선균을 선별하였다. 시험균중에서 피부병을 일으키는 pathogenic yeast인 Cryptococcus laurentii에 대해서 재현성과 높은 항균력을 나타내는 방선균 균주 EMP22를 최종 선별하였다. 토양 분리 균주인 EMP22는 화학 동정과 Taxon program을 이용한 수리동정 결과, 형태적 특성이나 현미경 관찰, 세포벽의 성분 분석으로 Streptomyces 속에 속함을 알았고 Streptomyces 주군집 1B(S.anulatus)에대해 0.999073의 높은 Willcox probability를 나타내며, cluster 1B의 구성균종 38주 중에서 Streptomyces willmorei로 동정되었다. 따라서 본 분리균을 Streptomyces willmorei EMP22로 명명하였다. S. willmorei EMP22가 생성하는 항진균물질은 대상시험균인 C. laurentii의 swelling을 유도하므로 이 항진균물질은 yeast의 세포벽 생성을 억제하는 기작을 가진 물질임을 추정할 수 있었다. S. willmorei EMP22가 생산하는 항진균물질의 항균 스텍트럼을 보면 G(+) 세균과 진균에 대해서는 항균력을 보이고, G(-) 세균에 대해서는 항균력을 보이지 않았다. Batch culture를 통해서 S. willmorei EMP22가 생산하는 항진균물질의 최대 활성 시기가 4일로 나타났다. 항진균성 항생물질의 최적 생산 조건을 조사하여 glucose와 yeast extract를 가장 좋은 탄소원과 질소원으로 결정하였고 이를 배지 성분으로 하는 yeast malt extract 배지를 항생물질 생산배지로 최종 선택하였다. 예비실험으로 온도 및 pH 안정성, 유기용매에 대한 추출성 및 각종 수지에 대한 홉착성을 조사하였다. pH는 6∼8에서 안정하며 알칼리로 갈수록 항균력이 감소하고, 온도는 100℃에서 1시간 정도까지는 다소 안정적이었다. 유기 용매로는 n-butanol에 대해 추출성을 보이고, 이온교환수지는 비이온성 Amberite XAD-2에 대해 높은 흡착성을 보여서 정제단계에 이용하였다. 분리과정은 S. willmorei EMP22 배양액으로부터 항생물질을 Butanol 추출, Silica gel 크로마토그래피, Amberlite XAD-2 (비이온성) 이온교환수지, 분취용 TLC, 분취용 HPLC 등을 사용하여 분리하였다.;The aim of the present research program was to develop a strain of actinomycetes producing antifungal antibiotics and to construct an optimum fermentation system. Soil samples were collected from various sites in Korea and 513 actinomycetes grown on chitin agar medium were isolated from the soil samples by applying pretreatments. 59 Streptomyces sp. strains were first screened for the presence of antifungal activity against fungal test organisms and five strains were secondly screened. Finally, a strain EMP22 producing antibiotics against pathogenic Cryptococcus laurentii among over 513 isolates were selected. The result of this study showed the identification of Streptomyces sp. EMP22. Forthemore it described the purification of antifungal antibiotics. Characteristics of cell culture, morphology and chemical composition of cell wall were analyzed for generic identification of the isolate EMF22 . Then numerical identification was carried out by analyzing fifty unit characters using TAXON program containing of database of Streptomyces identification probability matrix for the identification for the species level. The isolate EMP22 was identified to Streptomyces willmorei in the Streptomyces major cluster 1B. So the isolate was identified as Streptomyces willmorei EMP22 to avoid overspecification. The antibiotics producing by Streptomyces willmorei EMP22 caused swelling of C. laurentii, showing that the antibiotics might be a inhibitor of cell wall synthesis. From the batch culture data, it was obeerved that optimum antibiotics production period is 84 hours and the production of antibiotics were related to mycelial growth and was affected by medium composition. Glucose and yeast extract were proved to be good carbon source and nitrogen source, respectively. For the pH stability, the antibiotics shows stable antifungal activity at the range of pH 6∼8. For the heat stability, the antibiotics is still active after the treatment at 100℃ for 1 hour indicating high thermal stability. For the solvent extraction test, antibiotics was extracted with n-butanol at two times and for the resin absorbation test, antibiotics was strongly absorbed with nonionic Amberlite XAD-2 resin. The antibiotics in culture filtrate of S. willmorei EMP22 was purified by Butanol extraction, Silica gel chromatography, Amberlite XAD-2 (nonionic form) chromatography, Preparative TLC, and Preparative HPLC.
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