대장균 및 CHO 세포에서 Human Papillomavirus 16형 (HPV-16) L1, L2 유전자의 발현

Abstract

자궁암 유발에 중요한 요인으로 작용하는 Human papillomavirus 16형 (HPV-16)의 감염 진단 시약과 예방 백신 개발에 필요한 HPV-16의 표면 단백질을 생산하기 위하여 대장균 BL21(DE3)과 CHO 세포에서 표면 단백질을 암호화하는 L1과 L2 ORFs의 발현을 시도하였다. HPV-16 L1, L2를 대장균 BL21(DE3)에서 생산하기 위해 L1, L2 ORFs를 pGEX-2T와 pET3a 벡터에 클로닝하여 발현시켰다. 그 결과, L1 단백질의 발현은 pGEX-2T/L1의 경우 약 83 kDa의 불용성인 GST 융합단백질로, pET3a/L1은 약 57 kDa의 불용성 단백질로 각각 나타났으나 발현되는 양이 극히 적어서 HPV-16 L1의 단클론 항체인 Camvir-1에 의한 Western blot 분석으로만 확인이 가능했다. L2 단백질의 발현을 SDS-PAGE에 의해서 확인이 가능하였으며 pGEX-2T/L2는 약 104 kDa의 불용성인 GST 융합단백질로, pET3a/L2는 약 78 kDa의 불용성 단백질로 각각 발현되었다. 이 중에서 발현이 더 잘된 pET3a/L2의 78 kDa L2 단백질을 분리하여 토끼에 면역하여 HPV-16 L2에 대한 다클론 항체를 얻었다. L1과 L2 ORFs를 동물 세포에서 발현시키기 위해 발현 벡터 pNeoSRαⅡ와 pFRSVSRα에 클로닝하여 CH0 세포에 transfection시켰다. 이 때 pNeoSRαⅡ/L1과 pFRSVSRα/L1을 함께 그리고 pNeoSRαⅡ/L2과 pFRSVSRα/L2를 함께 CHO 세포에 cotransfection시킨 후 G418을 함유한 선택 배지에서 transfection된 클론들을 선별하였다. 선별된 클론들로부터 genomic DNA를 분리하여 PCR분석과 Southern blot hybridization을 하여 L1과 L2유전자가 CHO 세포의 DNA로 삽입되었음을 확인할 수 있었지만 이들 클론들에서 아직 충분한 L1, L2단백질의 발현은 확인할 수 없었다.;The L1 and L2 coat protein genes of HPV-16 which is one of the high risk type HPVs in the development of cervical cancer were cloned into bacterial expression vector, pGEX-2T and pET3a, and were expressed in E.coli BL21 by induction with IPTG. The L1 gene was expressed as about 83 kDa fusion protein with GST (glutathione S-transferase, 26 kDa) from pGEX-2T/L1 and 57 kDa protein from pET3a/L1. However, the intracellular level of the L1 protein was low, and it was only detectable by Western blot analysis with monoclonal antibody of HPV- 16 L1, Camvir-1. The L2 gene was expressed as about 104 kDa fusion protein with GST from pGEX-2T/L2 and 78 kDa protein from pET3a/L2 which were identified by SDS-PAGE analysis. The 78 kDa protein was purified by gel elution after SDS-PAGE and injected to a rabbit. From the antiserum of the immunized rabbit, polyclonal antibody against HPV-16 L2 was obtained. Futhermore, to express L1 and L2 coat proteins in mammalian cells, each L1 or L2 gene was cloned into two mammalian expression vectors, pNeoSRaII and pFRSVSRa. The recombinant pNeosRaII/L1 and pFRSVSRa/L1 were cotransfected to CHO cells. pNeoSRaII/L2 and pFRSVSRa/L2 were also cotransfected to CHO cells. Transfected clones were obtained from these cells by selection with G418 and amplified with MTX. It was identified that the transfectants had the nucleotide sequences of L1 or L2 of HPV-16 in their genomic DNA by PCR analysis and Southern blot hybridization. However, the expression of L1 and L2 in CHO cells was not yet identified by Western blot analysis. The expressed coat proteins of HPV-16 in E.coli and mammalian cell may be useful in diagnosis assay of HPV-16 infection and for the vaccine development.