Studies on the tumor suppressive function of AHNAK

Abstract

Ahnak is an exceptionally large protein (700kDa) and contains 36 central repeated units (CRUs) of highly conserved 128 residues. Each repeated unit shares more than 80% identity. Because of this unique structure, Ahnak has been proposed to be a scaffolding protein in cellular signaling. Previous biochemical results suggested that Ahnak might act as tumor suppressor. In order to elucidate tumor suppressive function of Ahnak, I established and analyzed Ahnak knockout mice (Ahank-/-) with mammary gland-targeted expression of polyoma middle T antigen (PyMT). MMTV-PyVT Ahank-/- mice produce more severe hyperplasia on mammary gland duct than Ahank-/+ mice. Loss of Ahnak resulted in development of malignant tumor analyzed by H&E staining and PCNA. These results show Ahnak plays a key role in tumor suppression. Ahank-/- mice display distinct phenotypical changes. Size of Ahank-/- mice is small compared to wild type and the mice have less gonadal fat than wild type. Old mice (onset 6-month-old) have inflammation lesion around the eye area and severe dermatitis. Keratinocytes in inflammation lesion contain severe hemosiderin deposits. To investigate generation of inflammation lesion, we measured immune responses in terms of cytokine production by LPS in peritoneal macrophages. Stimulation of macrophage with LPS for 6hr resulted in increase proinflammotry cytokines, IL-1β, and TNF-α compared to wild type. The result suggests that Ahnak might be involved in inflammation process from peritoneal macrophage.;neuroblastoma 세포와 피부 상피세포에서 처음으로 클로닝된 AHNAK은, 700kDa에 달하는 비정상적인 크기로 인해 유대어로 “거인(Giant)”을 뜻하는 ‘AHNAK’으로 명명되었다. AHNAK 단백질은, 250 개의 아미노산으로 이루어진 NH2-termius, 1,002 개의 아미노산으로 이루어진 COOH-말단 사이에 4,392 개의 아미노산으로 이루어진 중앙반복구조로 이루어져 있고 전체적인 구조는 아령모양이지만 중앙반복구조의 경우 구형으로 되어있다. 중앙반복구조는 128개의 아미노산이 36회 반복되는데 각각의 중앙반복구조는 80%의 동일성을 가진다. 이 특이한 구조로 인해 AHNAK은 여러 가지 외부신호에 반응하여 작동되는 세포내 신호전달체계에 있어서 scaffolding protein으로서의 역할을 할 것이라고 여겨지고 있다. AHANK은 칼슘이온의 항상성 유지에 기여하고 cytoskeleton의 토대를 이룬다는 보고가 있으며 최근에는 암과 혈관생성과 관련하여 중요한 역할을 한다는 보고도 있다. 그러나 아직까지도 AHNAK의 생화학적 역할에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. 그러나 AHNAK의 중앙반복구조는, scaffolding protein으로 작용하는 것뿐만 아니라 거대함에서 오는 진화적 불이익을 막기 위해서라도 다양한 기능을 담당하고 있으리라 생각된다. AHNAK의 tumor suppressive 기능을 알기 위해서 우리는 먼저 AHNAK knockout(-/-) mice를 만들었으며, 실제 종양을 일으키기 위해 mammary gland-targeted expression of polyoma middle T antigen(PyVT)을 가진 MMTV-PyVT mice 와 교배하여 MMTV-PyVT Ahnak-/- mice 를 만들었다. 교배된 mice중 Ahnak-/- mice는 같은 6주 연령대에 Ahnsk+/- mice보다 훨씬 더 현저하게 mammary gland에 hyperplasia가 일어났으며 mammary gland tumor 형성의 조짐을 보다 더 일찍 보였다. 개체에 있어서 Ahnak의 상실이 malignamt tumor와 연관이 되어있다는 것을 H&E와 PCNA염색법으로 확인하였다. Ahnak-/- mice는 형질적 특이성을 가지는데, 첫째로 사이즈가 Ahnak+/-보다 현저히 작고 gonadal fat 또한 현저히 적다는 점이다. 그리고 6개월 이상이 된 Ahnak-/- mice는 눈 주변에 unilateral 하게 심각한 inflammation 이 일어난 다는 점이다. Inflammation이 일어난 keratinocyte를 떼어서 조직염색을 한 결과, 이 부위에 hemosiderin deposit이 있다는 것이 확인 되었다. 이러한 현상의 원인을 알아보고자 peritoneal macrophage를 추출하여 LPS자극 하에 어떤 cytokine들이 유도되는 지를 알아보았다. 6시간 동안의 LPS자극 하에 유도된 cytokine 중에서 IL-1β와 TNF-α가 wildtype 에 비교했을 때 knockout보다 더 많이 발현되었으며 이 결과로서 Ahank이 inflammation process에도 연관이 될 수 있다는 것을 보였다.