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Effects of cysteine mutations in the N-terminus truncated IgE-dependent histamine-releasing factor on dimerization and cytokine-like activity

Effects of cysteine mutations in the N-terminus truncated IgE-dependent histamine-releasing factor on dimerization and cytokine-like activity
Issue Date
대학원 분자생명과학부
이화여자대학교 대학원
IgE-의존적 HRF는 만성 알러지 질환의 발생에 있어서 주요한 작용을 한다고 알려져 있다. HRF는 친수성을 지닌 세포질내에 존재하는 단백질로서 Na,K-ATPase의 활성 저해제로도 알려져 있다. 더불어 세포 밖에서 관찰되는 HRF는 대식세포와 혈소판 배양액, 후기 알러지 반응 환자의 비세척액 등에서 검출되고 히스타민 분비능을 가지고, 따라서 histamine-releasing factor(HRF)로 명명되었다. HRF는 호산구의 화학 주성 (chemotaxis)을 유발함으로 호산구의 IL-8 분비를 증가시키는 능력을 지닌다. 최근 Budde (2002) 등은 단핵구 배양 상등액에서 분리한 HRF (HRFmn)와 재조합 HRF (rHRF)가 호염기구에서 히스타민을 분비하도록 유도하는 기전에 있어서 동일한 능력을 지니지 않음을 보고한 바 있다. 더불어 특이적인 효소 결합 면역 흡착 검사 (ELISA) 결과를 토대로 HRFmn과 rHRF 사이에 구조적 차이점이 있음을 시사했다. 이를 바탕으로 본 연구에서는 특정 활성형 HRF가 존재하고, 이는 HRF에 존재하는 cysteine 아미노산 잔기를 경유하여 intermolecular disulfide bond에 의한 구조적 변형에 기인할 것이라는 가설을 세웠다. 이 가설을 증명하기 위해 N-terminus의 특정 아미노산 서열이 잘린 변형된 단백질을 가지고 총 4개의 돌연변이 HRF 구조체 (Del-N11HRF C28S, Del-N11HRF C172S, Del-N11HRF C28SC172S, Del-N35HRF C172S)를 제작했다. 이분자체를 확인하기 위해 gel-mobility shift assay와 gel-filtration assay를 이용하였고, 돌연변이 HRF 구조체에서 이분자체 비율이 현저히 감소함을 확인했다. 또한, BEAS-2B 세포에서 IL-8 분비능을 비교한 결과 돌연변이를 통한 구조 변화가 IL-8 분비를 효과적으로 억제함을 보였다. 본 논문은 HRF의 사이토카인 유사능에 이중체 형성이 수반됨을 밝히고, 28번과 172번 두 개의 cysteine 이 이중체 형성에 중요한 역할을 하며, 특히 172번 잔기가 이중체 형성에 더욱 중요한 인자임을 확인했다.;IgE-dependent histamine-releasing factor (HRF) is known to play a predominant role in the pathogenesis of chronic allergic diseases. HRF is found extracellularly in the culture supernatant of macrophage and platelets, in the fluid of nasal lavages, and in skin blisters of allergic patients with late-phase reaction (LPR) as well as intracellularly as a cytoplasmic repressor of Na,K-ATPase. Human recombinant HRF (HrHRF) directly stimulates histamine release and IL-4 and IL-13 secretion from basophils, and causes chemotaxis for eosinophils and increases IL-8 secretion from eosinophils. Recent study has shown that HRF produced by mononuclear cell (HRFmn) and recombinant HRF (rHRF) are not equivalent in the bioassay. rHRF was less effective than HRFmn in histamine release activity, and HRFmn could not be detected as measured by an rHRF-specific ELISA assay, suggesting that HRFmn might possess a different conformation compared with rHRF. Our group found that N-terminus truncation of rat rHRF (RrHRF) forms dimers and is necessary to achieve an active form of HRF. In this study, I hypothesized that N-terminus truncation of RrHRF which converts monomer to dimer might be due to intermolecular disulfide bond via cysteine residues of RrHRF. Here, I manufactured four constructs of cysteine mutations (Del-N11HRF C28S, Del-N11HRF C172S, Del-N11HRF C28SC172S, and Del-N35HRF C172S) to investigate whether the intermolecular disulfide bond play an important role in dimerization. Using gel-mobility shift assay and gel-filtration assay, I showed that dimerization was decreased in mutant RrHRFs and that mutant RrHRFs significantly inhibited the release of IL-8 from BEAS-2B cells. In conclusion, dimerization of the N-terminus truncated RrHRFs might be a key factor to be an active form harboring cytokine-like activity, and two cysteine residues of 28 and 172 play a critical role in the formation of dimeric structure, and the cysteine residue of 172 is regarded as the main site of dimerization.
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