Development of high throughput screening system for Sulfiredoxin inhibitors

Abstract

Peroxiredoxin은 hydorogen peroxide를 환원하는 peroxidase이다. Yeast thiol-specific antioxidants 1 (yTSA1)은 yeast peroxiredoxin이고 두개의 cysteine 잔기를 지니고 있다. Catalytic cycle에서 2-Cys Prx는 hydrogen peroxide를 제거하기 위해 N-termonal Cys-SH가 Sulfenic aicd (Cys-SOH)로 전환된다. 그러나 Prx가 과한 oxidation이 되면 cysteine sulfinic acid (Cys-SO2H)로 더 산화되게 된다. 이러한 sulfinylated Prx를 sulfiredoxin (Srx) 이라는 효소가 환원하는 역할을 하는 것으로 알려졌다. 생체내에서 증가된 활성 산소종 (ROS)은 암과 같은 생물학적 현상에 영향을 미친다. 암의 치료에 사용하는 radiation은 생체내에 free radical을 생성한다. 이로 인해 생체내의 Prx와 같은 항산화단백질이 증가되면 암 세포는 radiation 치료와 ROS에 대하여 저항력을 가지게 된다. 이러한 상태가 지속되면 생체는 ROS에 대하여 저항성을 지니게 되고 이는 곧 암세포가 죽는 것을 방해하게 된다. Srx의 저해제를 찾는 것은 암세포가 ROS에 대한 저항성을 가지는 것을 저해하므로 암의 치료제로서 사용될 수 있다. Srx 저해제를 스크리닝 하는 시스템을 개발하기 위해, 첫번째로 TSA1의 산화정도를 NADPH-coupled assay로 측정하였다. Srx의 활성정도를 측정하기 위해, Srx와 TSA1을 함께 반응시킨 후 NADPH-coupled assay에 적용하였다. TSA1의 산화정도와 Srx의 활성을 더 확실히 보기 위해, 2-D immunoblot과 NADPH-coupled assay를 함께 진행하여 그 결과를 비교하였다. 그 다음으로, 효율적인 assay 시스템을 개발하기 위해 다양한 농도의 단백질과 효소를 NADPH-coupled assay에 적용시켰다. 이러한 결과를 통해, 우리는 mammalian Srx의 화학적 저해제를 스크리닝 할 수 있는 high throughput assay를 개발하였다.;Peroxiredoxins (Prx) are a family of peroxidases that reduce hydrogen peroxides. TSA1 (Thiol-specific antioxidants 1) is a yeast peroxiredoxin (Prx) and has two cysteines. In the catalytic cycle of 2-Cys Prx enzyme, to remove hydrogen peroxide, the N-terminal Cys-SH is converted to cysteine sulfenic acid (Cys-SOH) by a peroxide. However, overoxidized Prxs, converted to cysteine sulfenic acid (Cys-SO2H), could not reduced by catalytic cycle. The enzyme responsible for the reduction of sulfinylated Prx was subsequently identified and named sulfiredoxin (Srx). Increased ROS have an effect on biological phenomenon such as cancer. In cancer therapy radiation produce free radicals. Cancer cell have resistance to radiation therapy and ROS because of increased antioxidant activity of Prxs. As a result of these state, living body have resistance to ROS that interfere with death of cancer. Srx inhibitors protect cancer cell having resistance to ROS, therefore, finding of Srx inhibitors would be used for cancer durgs. For develop Srx inhibitor screening system, first, we carried out oxidation of TSA1 and test oxidation state through NADPH-coupled assay. To measure of Srx activity, Srx incubated with oxidized TSA1 and then applied to NADPH-coupled assay system. To confirm of TSA1 oxidation state and Srx activity, we compare 2-D immunoblot with NADPH-coupled assay. Then, to find effective assay system, diverse concentration of proteins and enzymes were applied to NADPH-coupled assay system. As a results, we established an assay for high throughput screening of chemical inhibitors of mammalian sulfiredoxins.