애기장대(Arabidopsis thaliana)에서의 SPF1-type DNA binding protein homologs의 기능 연구

Abstract

In higher plants, sugars are not only important energy source and structural components, also affect growth and development throughout the life cycle. A transcription factor named SPF1 was isolated from sweet potato, and it was reported that SPF1 binds to the SP8a and SP8b promoter elements of the β-amylase and sporamin genes related sugar metabolism. In study of fruit over-ripening process, we found that SPF1-like protein homolog from over-ripening watermelon flesh library and the expression of this homolog was increased in senescing watermelon and arabidopsis leaves. Because of difficulty in watermelon transformation, we searched the watermelon SPF1 homologous genes through Arabidopsis database, and then found 11 homologous genes. Among them 3 genes showing higher-similarity with sweet potato SPF1 gene were named temporally AtSPF1, AtSPF2 and AtSPF3. In phylogenetic analysis of AtWRKY family including 3 AtSPF genes, AtSPF1 is located on the high hierarchy than other two genes. From the research of genetic identification, it was revealed that the expressions of three genes were up- or down- regulated during developmental senescence and had different expression pattern in some organs. And the expressions of AtSPF2 and AtSPF3 were induced by various stresses like drought, cold and salt. Although there were no significant alterations in gene expressions by sugars like sucrose, glucose and fructose, AtSPF1 and 3 transgenic plants showed longer hypocotyls length in various sugar treatment regardless of up or down regulation. Although these transgenic plants did not show the alteration of life cycle, AtSPF1 over-expressing transgenic plant was revealed the phenotype showing pale green and downward rolling leaf morphology and reduced seed productivity. But AtSPF3 over-expressing transgenic plant showed the normal leaf shape and high seed productivity due to increase of silique number. According to the co-express gene database search, AtSPF1 was found to be associated with F-box protein and AtSPF3 connected with AP2, ERF domain protein and ACC synthase. From these results, 3 AtSPF genes would be related to plant growth and development affected by sugars indirectly, and they would be had a role individually as a member of AtWRKY family.;고등 식물에서, 당은 에너지 대사의 주요 물질이고 세포의 구성성분일 뿐만 아니라 발아에서부터 노화에 이르기까지 식물체의 생활사 전반에 걸쳐 성장과 발달에 중요한 역할을 수행하는 물질이다. 수박을 대상으로 진행된 과일의 숙성에 관한 연구 중 SPF1-like protein homolog가 수박 잎의 노화기에 발현이 증가됨을 확인하였으나 형질전환체 제작이 용이하지 않은 박과 작물의 특징으로 인하여 그 기능을 밝히는데 어려움이 있었다. 따라서 본 연구에서는 이 유전자의 기능을 밝히기 위해, 모델 식물인 애기장대에서 이 유전자의 homolog를 분석하고 해당 유전자의 돌연 변이로 인한 생리적 영향을 조사하였다. 애기장대에는 1개 혹은 2개의 WRKY domain을 가지는 총 11개의 유사 유전자가 있으며 이 중 고구마의 SPF1과 30% 이상의 유사성을 보이는 3개의 유전자를 임의적으로 선별하여 AtSPF1, AtSPF2, AtSPF3라 명명하였다. 본 논문에서는 이들 유전자가 고구마에서 밝혀진 SPF1과 같이 당과의 연관성을 가지고 있는지 아니면 WRKY family의 일원으로서 이들이 관여하는 다양한 기능 중 하나에 관련되어 있는지 알아보고자 하였다. SPF1 유전자가 당의 영향을 받는 전사 조절 인자로 보고되었으므로 세 유전자도 당에 의하여 직접적인 영향을 받는지 알아보기 위하여 sucrose, glucose, fructose를 여러 농도로 처리하여 유전자의 발현을 살펴보았으나 세 유전자 모두 당의 종류나 농도에 따른 발현 변화를 나타내지 않았으므로 세 유전자는 기존에 밝혀진 SPF1과 유사성을 보이지만 당의 직접적인 영향을 받는 것은 아닌 것으로 여겨진다. 또한 형질전환체 전반에서 하배축의 길이가 야생형에 비해 길어지므로 유식물과 같은 성장초기와 관련성이 있을 것이라 추측되나 유전자의 발현을 억제시킨 경우와 증가시킨 경우 모두에서 성장이 촉진되므로 당에 의한 직접적인 영향이나 당 관련 신호전달 과정에 관련되어 있을 가능성은 적은 것으로 사료된다. 세 유전자는 공통적으로 식물체의 노화가 진행되는 발달 단계의 후반에서 발현이 증가되었고 이 중 AtSPF2와 3는 가뭄, 저온, 염과 같은 여러 스트레스 처리에 의하여 뚜렷하지는 않지만 발현이 증가되거나 감소되는 경향을 나타내었다. AtSPF1과 AtSPF3 유전자의 경우는 형질전환체를 대상으로 노화 관련성을 확인하여 보았으나 뚜렷한 생활사의 변화를 확인하지 못했다. 성장 관련성을 확인하는 과정에서 야생형에 비하여 두 유전자의 형질전환체의 발아율이 높은 것을 관찰하였고, 두 유전자가 WRKY family로서 당을 비롯한 여러 스트레스 하에서 발아에 어떠한 영향을 미치는지 살펴본 결과 AtSPF1의 과발현체는 염 스트레스와 발아 억제 호르몬인 ABA 처리시 발아율이 감소되는 경향을 보였으며 AtSPF3의 과발현체는 염 스트레스 하에서 발아율이 감소 되었다. AtSPF1과 AtSPF3 유전자의 형질전환체는 잎의 형태적인 발달이나 종자 생산량에서 차이를 나타내었다. AtSPF1의 과발현체에서 나타나는 잎의 색이 연해지고 뒤쪽으로 말리는 표현형에서 잎의 색은 엽록소 양의 감소에 기인하는 것이었고 AtSPF3 과발현체는 꼬투리 수의 증가로 인하여 종자 생산량이 증가되는 경향을 나타내었다. AtSPF1의 발현은 AtSPF3 유전자의 발현에 영향을 미치지 않았으며 반대의 경우도 같은 결과를 나타내었다. 따라서 두 유전자는 각각의 기능을 가지는 것으로 추측하여 볼 수 있으며 기존에 보고된 database를 통하여 상관관계를 갖는 유전자에 대하여 분석해본 결과 AtSPF1은 다수의 F-box protein family와 연관관계를 갖는 것으로 나타났고, AtSPF3는 AP2, ERF domain protein, ACC synthase 등과 관련되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들을 바탕으로 AtSPF1, 2, 3 유전자는 당에 의하여 직접적으로 발현을 조절 받지는 않으나 AtWRKY family의 일원으로 식물체의 성장과 발달에 관련된 각각의 기능을 가지고 있는 것으로 사료된다.