모유의 수유 기간에 따른 GANGLIOSIDE변화와 SIALIDASE분리ㆍ정제 및 특성에 관한 연구

Abstract

It has been observed that the content and composition of gangliosides in human milk change upon the length of lactation period. In the early stage of lactation the content of the gangliosides in human milk appears to be rich and the major component of the gangliosides is GD3. However the content of GM3 increased in the mature milk, while that of GD3 decreased. In order to understand the biological importance of this compositional change, sialidase, a ganglioside-hydrolyzing enzyme, was studied. It has been also found that the enzyme activity decreases as the lactation period increasing. An investigation of the enzyme activity has reviewed the fetuin, sialyllactose, and GDla ganglioside are considered to be good substrates for the human milk sialidase. The Km value of the bovine brain ganglioside mixture which contains GDla and GM1 as major components was obtained to be 97.65 μM. Unexpectedly, the enzyme activity at 95℃ is about 4 times greater than the one at 37℃, indicating the the human milk sialidase would be considered to be present as an insoluble form. The activity of the human milk sialidase shows maxima at pH 5.6, pH 7.0. and pH 8.0, indicating that exists in multiple types. And it appears that the protein having approximate molecular weights of 49,000 dalton would exhbit the enzyme activity according to SDS-PAGE.;본 연구에서는 수유기간이 다른 모유에서 gangliosides를 분리하여 조성의 변화를 관찰하고, 이러한 변화의 생물학적 중요성을 알아보기 위하여 gangliosides 분해 효소중 하나인 sialidase를 조사하였다. Gangliosides는 Folch-Suzuki 방법으로 추출하여 HPTLC로 분석하였고 효소 활성은 periodate/2-thiobarbituric acid 방법으로 측정하였다. HPTLC로 분석한 결과 6일째 모유에서는 GD3와 GDla가 주요 gangliosides로 존재하고 GM3는 거의 보여지지 않은 반면 17일 이후의 모유에서는 GD3와 GM3가 주요 gangliosides로 존재하였다. 수유기간이 증가함에 따라 gangliosides 함량이 감소하였다. 또한 모유에 존재하는 대부분의 sialic acid는 당단백질에 결합되어 있음을 알 수 있었다. 수유기간에 따라 sialidase 활성이 감소되었는데, 변화 양상은 gangliosides 함량의 변화와 유사하였다. 따라서 sialoglycoconjugates의 sialylation 정도와 sialidase와의 상호 관련성을 예상할 수 있었다. 모유에 존재하는 sialidase는 기질로서 g1ycosphingolipids인 gangliosides보다는 oligosaccharide인 sialyllactose와 g1ycoprotein인 fetuin을 사용하였을 때 활성이 높게 관찰되었고, gangliosides중에서는 GDla에 대한 활성이 높았다. GDla와 GM1이 주요 성분으로 존재하는 bovine brain ganglioside mixture에 대한 Km 값은 97.65μM이었다. 효소 용액을 95℃로 전처리하면 sialidase 활성이 4배까지 증가하는 것을 관찰하였다. 이로부터 모유에 존재하는 sialidase가 free한 형태로 존재하지 않는 것으로 예상하였다. 또한 모유의 sialidase는 pH 5.6과 7, 그리고 8에서 높은 활성을 보였으므로 pH에 따라 활성이 다른 multiple enzyme으로 추측하였고, 그 분자량은 대략 49,000 Dalton으로 추정되었다.