Arthrobacter simplex IAM 1660로부터 Steroid △¹-dehydrogenase 의 분리정제 및 특성

Abstract

미생물에서 steroid 모핵의 효소적 분해에는, Δ^(1)-Dehydrogenation과 9α-hydrxylation 이 선행 되어야 한다고 추정된다. 따라서 Steroid Δ^(1)-dehydrogenase는 세균의 sterol 분해과정에서 탄소 9,10 결합 분해에 중요한 역할을 할 뿐 아니라 산업적으로도 corticosteroid 약물제조에 필수적이다. 본 연구에서 균주는 A. simplex를 썼고 hydrocortisone을 기질로 사용하여 prednisolone을 산물로 얻었다. Prednisolone은 특히 항소염제로 관절염과 알레르기병에 성공적으로 사용되어지는 유용한 steroid이다. Steroid Δ^(1)-dehydrogenase는 steroid biotransformation에 관여하는 다른 대부분의 효소와 마찬가지로 inducible, membrane-associated 효소로 알려져있다. Steroid Δ^(1)-dehydrogenase를 순수분리 정제하기 위하여 이 효소가 유도된 다량의 균체를 준비하였으며 glass bead-beater를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 막 파편과 복합체를 이뤄 나온 효소를 제거하기 위해 100,000xg 90min간 초원심분리를 하였으며 이 상등액을 조효소액으로 하여 steptomycin sulfate 침전, ammonium sulfate fractionation 하였으며 DEAE-cellulose, Hydroxyapatite, Phenyl-sepharose CL-4B 등의 colum chromatography를 행하여 정제하였고 SDS polyacrylamide disc gel electrophoresis로 분자량을 약 75,000으로 추정하였다. Steroid Δ^(1)-dehydrogenase의 촉매적 특성에서 phenazine methosulfate를 electron acceptor로 사용하였을 때 가장 효율이 좋았고, 최적 pH는 9.0이었고, 최적 온도는 35℃였다.;Steroid Δ^(1)-dehydrogenation is supposed to relate with cabon 9.10 bond cleavage of steroid nucleus degradation by microorganisms, thus it is recognized as an important enzyme. Hydrocortisone is converted to prednisolone by Steroid Δ^(1)-dehydrogenase of A . simplex. The prednisolone is being used as a phamaceutic drug, due to its antirheumatic and antiallergic activity. This study has been aimed at the purification of steroid Δ^(1)-dehydrogenase in order to understand the action mechanism of this enzyme. For the purification of this enzyme, a lot of cell paste was prepared and disrupted by glass bead-beater for 8 min. For the removal of membrane-enzyme complex particles, ultracentrifuge at l00,000xg, 90 min was carried out. The supernatant which is contained the solubilized enzyme was used as a crude enzyme solution. After the crude enzyme solution treated with streptomycin sill fate, ammonium sulfate fractionation, DEAE-cellulose, hydroxyapatite, and phenyl-sepharose CL-4B column chromatography had been carried out. The analysis of eluate from phenyl-sepharose CL-4B column chromatography on SDS polyacrylamide disc gel electrophoresis result is about 75,000 dalton protein band. It was observed that the optimum pH of steroid Δ^(1)-dehydrogenase is 9.0 and optimum temperature of this enzyme is 35℃ in the presence of 0.3mM PMS.