Cellulomonas속 균주의 원형질체 융합에 대하여

Abstract

In order to establish the process of a interspecific protoplast fusion and obtain fusants of the genus Cellulomonas capable of utilizing of cellulose, C. flavigena NCIB 12901 and Cellulomonas sp. CS1-1, the optimum conditions for the formation and the regeneration of protoplast of C. flavigena were investigated. And then, for the protoplast fusion between the mutants isolated by NTG treatment, the optimum conditions were examined and recombinant fusants were selected. Cells of C. flavigena harvested from mid exponential phase and resuspended in hypertonic solution containing osmotic stabilizer were treated with lysozyme and they formed protoplast. For the purpose of cell wall regeneration, protoplasts were plated on the regeneration complete agar medium (RCM) containing osmotic stabilizer and overlaid with same medium containing 0.8% soft agar. For the interspecific fusion protoplasts of the two strains of auxotrophic and antibiotics resistant mutants were mixed and induced fusion by being added fusogenic agent. The fused protoplasts were regenerated on the RCM containing antibiotics and fusants were selected. The observation of regenerants and process of protoplast fusion were made by scanning electron microscopy. The condition of suitable osmotic stabilizer for the protoplast formation and regeneration of C. flavigena was established by using 0.4M sorbitol. The optimum pH was 6.5 on protoplast formation. By addition of 3% polyvinyl pyrrolidone (PVP) to cell wall regeneration medium (RCM), regeneration frequency was increased 3 times higher than in the case without PVP addition. The optimal conditions for the interspecific protoplast fusion between auxotrophic and antibiotics resistant mutants were obtains as following: fusogenic agent PEG 6000, 40% (w/v) treating time 15 min. concentration of Ca^(++)/ 25 mM The fusion frequency between mutants was from 2.0 x 10^(-4) to 4.0 x10^(-4) under the optimum conditions. The fusants were confirmed to revert from protoplast to cells of rod type during regeneration process and the aggregation of protoplasts by PEG was observed by light microscopy. Also the progress of protoplast fusion was observed by scanning electron microscopy. Many isolated fusants were shown to be complemented clones of both parents which occured at a high frequency among the isolated clones. Thus, the method of regeneration and interspecific fusion of the genus Cellulomonas have been successfully established.;Cellulose를 분해할 수 있는 Cellulomonas속 세균 Cellulomonas flavigena NCIB 12901과 Cellulomonas sp. CS 1-1의 종간 원형질체 융합 방법의 확립과 재조합체인 융합균주를 얻기 위하여 C. flavigena의 원형질체 형성 및 재생에 대하여 조사하였고, NTG 돌연변이 유발원을 이용하여 분리 선별한 변이주간에 polyethylene glycol(PEG)에 의한 원형질체 융합조건에 대해 알아보고 융합균주를 선별하였다. C. flavigena를 대수증식기 중기까지 배양하여 삼투압 안정제(osmotic stabilizer)를 포함하는 고장액에 현탁한 후 lysozyme을 처리하여 원형질체를 형성시킨다. 원형질체의 세포벽 재생은 삼투압 안정제를 포함하는 고장의 재생배지에 도말하고 0.8% 유동성 한천배지로 증층하여 재생시켰다. 또한 영양요구주, 항생물질 내성 변이주들을 lysozyme 처리하며 원형질체를 형성시킨 뒤 이를 혼합하고 융합 유도제 (fusogenic agent)를 처리하여 원형질체 융합을 유도하였다. 융합 원형질체는 융합선별배지상에서 재생시켜 정상세포로 전환된 융합균주를 선별하고 그들의 특성을 조사하였다. 각 과정에서 주사전자현미경을 통해 원형질체의 재생과 융합과정을 확인할 수 있었다. C. flavigena는 최적 삼투압 안정제로 당알콜인 sorbitol, 농도는 0.4M에서 높은 원형질체 형성율과 약 15%의 재생율을 보였으며 재생배지에 polyvinyl pyrrolidone(PVP) 3%를 첨가함으로써 재생빈도를 약 3배정도 증가시킬 수 있었다. 영양요구주와 항생물질 내성변이주 간에 종간 원형질체 융합은 융합 유도제인 PEG 6000으로 하여 40%(w/v) 농도에서 15분, Ca^(++) 농도 25mM을 처리하였을 때 최적 조건을 보였다. 원형질체 재생은 SEM을 통한 관찰로 구형의 원형질체에서 간상의 정상 세포로 전환된 것으로 확인할 수 있었으며 원형질체 융합은 PEG에 의한 원형질체간의 응집을 통한 융합과정을 관찰할 수 있었다. 원형질체 융합을 통해서 임의로 선별한 융합균주의 대부분은 양 모균주의 complemented clone으로 재조합체임을 보였으며 모균주보다 cellulase 활성이 향상된 융합균주를 분리해낼 수 있었다.