Study of LIME function in BCR-mediated B cell activation and TD Ag-induced germinal center reaction

Abstract

Transmembrane adapter proteins (TRAPs) are a group of adaptor proteins that contain short extracellular domain, transmembrane domain and cytosolic domain possessing multiple tyrosine phosphorylation sites. Upon immune receptor cross-linking by antigen, TRAPs are required for transmitting receptor-mediated membrane proximal signal to cytoplasm by scaffolding various signaling proteins. Lck-interacting membrane protein (LIME), one of TRAPs, was previously identified as a binding partner of Lck. LIME expression is mostly confined to hematopoietic cells such as T, B and mast cells. In T cells, in response to TCR stimulation, LIME is tyrosine phosphorylated by Lck and associates with signaling proteins such as Lck, PI3K, Grb2, Gads, and SHP-2. As LIME overexpression led to the MAPK and IL-2 promoter activation, LIME was suggested as the positive regulator of TCR signaling. However, the functions of LIME in other hematopoietic cells than T cells have not been clarified yet. Assembly of a signaling complex around the transmembrane adapter LAT is essential for the transmission of T-cell receptor (TCR)-mediated signaling. However, a LAT-like molecule responsible for the initial activation events in B-cell receptor (BCR) signaling has not yet been identified. Recently, LAB was suggested as a LAT analogue in B cells. However, LAB could not rescue normal T cell development in LAT knockout mice. Moreover, BCR-mediated calcium flux was normal in the absence of LAB. These findings suggest the presence of a second transmembrane adapter involved in BCR signaling. In the first part of this thesis, I describe characterization of the functions of LIME using B cell line and show that LIME is a transmembrane adaptor required for BCR-mediated B-cell activation. LIME was found to be expressed in mouse splenic B cells. Upon BCR-cross-linking, LIME was tyrosine-phosphorylated by Lyn and associated with Lyn, Grb2, PLC-γ2, and PI3K. Reduction of LIME expression by the introduction of siRNA resulted in the disruption of BCR-mediated activation of MAPK, calcium flux, NF-AT, PI3K, and NF-kB. Taken together, these results establish that LIME is an essential transmembrane adaptor linking BCR ligation to the downstream signaling events that lead to B-cell activation. Having established the biochemical functions of LIME in B cell line, in the second part, I was interested in investigating the immunological functions of LIME at the animal level. For this purpose, I characterized the functions of B cells from LIME-/- mice. In LIME-/- mice, B cell development was found as normal from bone marrow to periphery. BCR-mediated early activation signaling was only marginally affected and B cell activation by several mitogens including BCR stimulation was not affected in LIME-/- B cells suggesting that LIME is not involved in the activation of naïve B cells. Subsequently, LIME expression was found to increase markedly in GC B cell compared to naïve B cells by T cell-dependent signals, CD40+ IL-4. Moreover, immunoglobulin levels of LIME-/- mice immunized with T-dependent (TD) antigen but not T-independent (TI) antigen were significantly reduced compared to wild type mice. These results suggest that LIME functions in the germinal center after help from T cells. To clearly show that the observed defect in TD-antigen induced B cell response is due to intrinsic defect of LIME-/- B cells but not defect in the help from T cells, RAG2-/- mice was used as the host of wild type or LIME-/- B cells. In RAG2-/- mice transferred with LIME-/- B cells, antigen-specific immunoglobulin production was significantly diminished compared to those transferred with wild type B cells. Consistently, TD antigen-specific plasma cell number was dramatically reduced in RAG2-/- mice transferred with LIME-/- B cells. Moreover, the number and percentage of antigen-specific plasma cells were dramatically reduced in RAG2-/- mice transferred with LIME-/- B cells. These findings show that the absence of LIME led to the defect either in the differentiation to or the function of antigen-specific plasma cells and this defect is intrinsic to B cells. However, TD-antigen-dependent germinal center formation and germinal center reaction including affinity maturation and class switching occurred normally in LIME-/- mice. In addition, the number and percentage of Ag-specific GC B cells and memory B cells were normal in LIME-/- mice suggesting that LIME function is confined specifically in the plasma cells. In summary, I defined LIME as a transmembrane adapter mediating BCR-induced activation signaling and a key regulator of TD antigen-derived differentiation to and function of plasma cells in germinal center.;TRAPs (Transmembrane adapter proteins)은 짧은 extracellular domain, transmembrane domain, 그리고 타이로신 인산화될 수 있는 cytosolic domain으로 구성된 단백질들의 그룹을 말한다. 면역세포의 수용체가 항원에 의해서 활성화 되었을 때 이 TRAP은 여러 가지 신호전달 단백질들과 결합하여 수용체 매개 신호를 세포질 속으로 전달하는 중요한 역할을 한다. LIME (Lck-interacting membrane protein)은 이러한 TRAP의 한 종류로써, Lck의 결합단백질로써 처음 발견되었다. LIME은 주로 T, B 임파구와 같은hematopoietic 세포들에서 발현된다. T 임파구에서 LIME은 TCR 자극 시 Lck에 의해 타이로신 인산화 되며 이를 통해 Lck, PI3K, Grb2, Gads 그리고 SHP-2와 결합한다. LIME이 과 발현된 T임파구는 MAPK와 IL-2 promoter가 활성화 되어 있었고, 이러한 결과를 통해 LIME은 T 임파구 수용체 매개 신호전달에서 positive regulator로써 그 기능이 연구되어 있다. 그러나, T임파구 외의 다른 세포에서의 LIME의 기능은 현재까지 연구된 바가 없었다. TCR 자극 시 LAT을 중심으로 하는 signaling complex는 T 임파구 수용체매개 신호전달에서 필수적이라는 사실이 알려져 있다. 그러나 B 임파구 수용체 매개 신호전달과정에서 LAT과 같은 역할을 하는 TRAP이 알려진 바가 없었다. 그런데 최근LAB이라는 새로운 TRAP이 B 임파구에서 LAT의 functional homologue로써 기능 할 것이라는 보고가 있었다. 그러나 LAT knockout mice에서의 T cell developmental defect를 LAB이 rescue하지 못했고 또한 LAB knockout mice에서 B 임파구의 기능적인 defect가 발견되지 않았다. 이러한 결과들로부터 BCR signaling에 필수적인 또 다른 TRAP이 존재할 것이라는 예측을 할 수 있다. 첫 번째 장에서는, LIME이 B 임파구 수용체 매개 B 임파구 활성화 신호전달에서 필수적인 TRAP임을 규명하였다. LIME은 primary B 임파구에서 발현되고, 특히 BCR 자극 시 Lyn kinase에 의해 타이로신 인산화 되었다. 이 타이로신 인산화된 위치에 SH2 domain을 가진 Lyn, Grb2, PLC-γ2 그리고 PI3K가 결합하였다. A20 B 임파구 세포주에LIME의 발현을 억제했을 때 B 임파구 수용체 매개 MAPK, calcium flux, NF-AT, PI3K, 그리고 NF-kB 의 활성화가 억제되었다. 이러한 결과들로 볼 때 LIME은 BCR 자극을 하부 신호전달 과정으로 연결하여 B 임파구 활성화를 유도하는 필수적인 TRAP이라고 생각할 수 있다. 다음 장에서는, 위와 같은 LIME의 생화학적인 기능 이해를 기반으로 하여 동물 수준에서 LIME의 면역학적 기능을 연구하고자 하였다. 이를 위해 LIME KO (knockout) mice를 이용하였다. LIME KO 의 bone marrow에서부터 periphery에까지 이르는 B 임파구 발달은 정상B임파구와 차이가 없었다. Naïve B 임파구 수용체 매개 활성화 신호에 의한 MAPK 활성화와 calcium flux는 LIME KO B 임파구가 정상 B 임파구에 비해 약간 감소하였으나 여러 가지 B 임파구 자극 신호에 의한 activation marker의 표면 발현과 proliferation은 정상 B 임파구와 차이가 없었다. 그러나 LIME의 발현이 T 임파구에서 제공하는 CD40와 IL-4 신호에 의해 germinal center에서 증가한다는 사실을 확인 하였고, LIME KO mice의basal이나 TI 항원 (T임파구 비의존적 항원)에 의한 항체 형성은 정상 쥐와 차이가 없었지만 TD 항원 (T임파구 의존적 항원)에 의한 항체 형성 양은 감소하였다. 이러한 결과들로부터 LIME은 T임파구의 도움이 필요한 germinal center에서 기능할 것으로 예측된다. LIME의 기능을 좀 더B 임파구 특이적으로 조사하기 위하여 LIME KO 혹은 정상 B 임파구를 정상 CD4+ T 임파구와 함께 RAG2 KO mice로 adoptive transfer하였다. LIME KO B 임파구가 transfer된 RAG2 KO mice에 TD 항원을 주입하였을 때 이 항원 특이적인 항체의 양은 정상 B 임파구를 transfer한 RAG2 mice에서의 양에 비해 매우 감소되어 있었다. 이와 함께 항원 특이적인 plasma 세포의 수도 LIME KO B 임파구가 transfer된 RAG2 mice에서 감소되어 있었다. 그러나 이 때, TD 항원에 의한 affinity maturation 과 class switching과 같은 germinal center reaction은 정상 B 임파구가 transfer된 RAG2 KO와 차이가 없었다. 또한 germinal center 형성과 germinal center B 와 memory B 임파구의 수도 정상 B 임파구가 transfer된 RAG2 KO와 차이가 없었다. 이러한 결과는 LIME은 TD 항원에 의해 형성되는 plasma 세포의 발달에 특이적으로 기능하는 TRAP이라는 사실을 말해준다. 본 논문에서 LIME이 B 임파구 수용체 매개 활성화 신호전달에 필수적인 TRAP이며 TD 항원에 의한 plasma 세포 분화에 필수적인 조절자임을 밝혔다. 이를 통해 새로운B 임파구 수용체 매개 활성화 신호전달과TD 항원에 의한 plasma 세포로의 분화 조절 매커니즘을 규명하였다.