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Purification of caspase-12 and enzyme-substrate relationship of the caspase with other caspases

Purification of caspase-12 and enzyme-substrate relationship of the caspase with other caspases
Issue Date
대학원 분자생명과학부
이화여자대학교 대학원
ER (endoplasmic reticulum)에서 주로 발견되는 caspase-12는 Alzheimer s disease와 관련된 세포사멸에서 중요한 역할을 한다. 거의 알려진 것이 없는 그 경로를 설명하기 위한 초기의 노력으로서 caspase-12와 다른 caspase들의 관계를 in vitro상에서 조사하였다. caspase-3와 -7은 procaspase-12의 Asp24와 Asp94을 절단 시킬 수 있는 것에 반해 caspase-2, -6, -8, -9은 그렇지 못했다. 이러한 사실은 caspase-3와 -7이 caspase-12의 활성화를 유도하는 상위 caspase일 가능성을 제시한다. caspase-12의 여러 재조합들 중에서 오직 △pro1 (Gly95-Asn419), rev-△pro1 [(Thr319-Asn419)-(Gly95-Asp318)], rev-Dpro2 [(Thr319-Asn419)-(Thr159-Asp318)] 만이 E. coli에서 적절한 양으로 생산되었으며, 정제된 이 단백질들은 자기 자신인 procaspase-12를 절단 시켰을 뿐 procaspase-2, -3, -6, -7, -8, -9, ICAD, Bid는 절단 시키지 못했다. 이러한 결과는 caspase-12가상위 caspase일 가능성을 배제할 뿐 아니라 DNA를 절편화시키거나 mitochondria로부터 cytochrome c를 방출하게 하는 직접적인 상위 활성자일 가능성도 배제시킨다. caspase-12 △pro1을 일시적으로 발현시켰을 때 핵의 변화나 다른 세포사멸 단백질들의 processing이 나타나지 않았음에도 불구하고 세포사멸이 유도되었는데 이는 알려지지 않은 세포사멸 경로가 존재할 것임을 암시하는 결과이다. ; Caspase-12 detected mainly in the endoplasmic reticulum plays a critical role in Alzheimer s disease related cell death. As an initial effort to elucidate caspase-12 pathway, the relationship of the caspase and other caspases was examined in vitro. Caspases-3 and -7 but not -2, -6, -8, and -9 could cleave procaspase-12 after Asp24 and Asp94, providing a possibility that caspases-3 and -7 might be the upstream caspases leading to the activation of caspase-12. Among several constructs, only the △pro1 (Gly95-Asn419), rev-△pro1 [(Thr319-Asn419)]-[(Gly95-Asp318)] and rev-Dpro2 [(Thr319-Asn419)-(Thr159-Asp318)] forms of caspase-12 could be produced in a reasonable amount in E. coli. The purified proteins could cleave only procaspase-12 itself but not procaspases-2, -3, -6, -7, -8, -9, ICAD/DFF45 or Bid, indicating a rare possibility for caspase-12 as an upstream caspase or a direct upstream activator of DNA fragmentation and cytochrome c release from the mitochondria. Although the nuclear changes and the processing of the apoptotic proteins were not detectable, transient expression of the △pro1 could induce apoptosis, suggesting the existence of an unknown apoptotic pathway.
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