NADE is involved in smac-mediated cell death

Abstract

세포사멸(apoptosis)에 관한 신호가 mitochondria에 전달되면 Smac/DIABLO (Second mitochondria-derived activator of caspase)라는 IAP(Inhibitor of apoptosis protein)와 결합하는 단백질이 세포질로 방출된다. IAP는 본래 Caspase의 특정 부위에 결합함으로써 이 효소의 활성을 억제하고 있다가, 방출된 Smac/ DIABLO와 새로이 결합하면서 Caspase에서 떨어져 나오게 되고, Caspase는 활성상태로 전환된다. 결국 활성화된 Caspase에 의한 세포사멸은 가속화된다. 우리가 관심을 가져야 할 부분은 Smac 유전자를 완전히 제거한 mouse가 특별한 표현형을 갖지 않는 것으로 볼 때, Smac/DIABLO 외에 또 다른 기능 단백질이 존재하거나 세포사멸에 대한 또 다른 경로가 있을지도 모른다는 최근의 연구 결과이다. Smac에 의한 세포 사멸 메커니즘을 좀 더 이해하기 위해 Smac과 결합하는 단백질, 즉 위에서 제기된 첫 번째 가능성을 탐구했다. Yeast Two-hybrid method를 통한 실험결과 우리는 세포사멸에 관련하여 Smac에 결합하는 NADE (p75NTR-associated cell death Executor)라는 새로운 단백질을 찾을 수 있었다. NADE는 주로 신경세포의 p75NTR의 death domain에 결합하였다가 NGF (nerve growth factor)라는 성장 인자의 자극을 받게 되면 세포사멸을 유발한다. 그러나 최근 구조 분석을 통해 NADE는 위와 같은 receptor나 성장 인자가 없더라도 세포사멸을 유도한다는 것이 밝혀져 그 기능에 대한 다각적인 연구가 진행되고 있다. 한차례 실험을 통해 우리는 mammalian 세포에서 Smac과 NADE가 결합하여 세포질에 함께 존재한다는 사실을 알 수 있었다. 더욱 흥미로운 사실은 NADE가 과도하게 발현하였을 경우 NADE는 Smac을 mitochondria 외부로 방출하게 하는 일종의 세포사멸 신호로 작용한다는 것이다. 여기서 우리는 두 단백질의 결합을 통해 세포사멸에 관여하는 또 다른 경로 혹은 메커니즘이 존재할 수 있음을 발견하게 되었다. NADE와 Smac의 관련성과 Smac에 대한 NADE의 구체적인 기능을 연구하면서 우리가 관심을 가진 것은, 위에서 언급한 XIAP라는 단백질이다. Smac은 이 XIAP와 결합함으로써 그 기능을 수행하게 되는데 여기에 NADE가 어떤 기능을 할 것인지를 알아보았다. 최근 연구에 따르면 XIAP의 RING domain은 ubiquitination의 E3-ligase와 유사한 기능을 하는데 이에 의해 self-ubiquitination이 되며, Caspase 3, 7 혹은 Smac과 결합하여 이들을 ubiquitination시킴으로, 결과적으로 분해 시켜 세포사멸을 억제하는 역할을 한다고 보고되었다. 그래서 본 논문에서는 먼저 이 세 단백질은 서로 결합하여 ternary 주조를 형성함을 알았고, 여기에 NADE가 어떠한 작용을 하고 있는가를 살펴보았다. 실험적으로 NADE의 농도에 의존하여 Smac과 XIAP의 결합이 증가하였고, 또한 XIAP의 self-ubiquitination이 증가한다는 것이 입증되었다. 즉 NADE가 XIAP와 Smac 결합체에 자신도 결합함으로써 결합력을 공고히 하면서 동시에 XIAP의 self-ubiquitination를 가속화 시킨다는 것이다. 결국 이로 인해 자유로워진 Caspase는 정상적으로 활성화되고, NADE에 의해 Smac에 의한 세포사멸은 훨씬 더 촉진되는 것이다. 결론은 본래 세포사멸의 억제자인 XIAP가 Smac의 방출로 인해 Caspase를 억제하지 못하며, NADE는 새로이 결합된 XIAP와 Smac에 추가로 결합하여 XIAP의 self-ubiquitination을 촉진하게 된다. 결국 XIAP는 분해되고, 본래의 기능인 Caspase와 Smac의 ubiquitination을 수행할 수 없게 된다. 따라서 Caspase가 활성화 됨과 동시에 억제자인 XIAP는 상대적으로 줄어들게 되어 세포사멸은 더욱 가속화되게 된다. ; Smac (second mitochondria-derived activator of caspases)/ DIABLO, an IAP (inhibitor of apoptosis protein)-binding protein, is released from mitochondria and potentiates apoptosis by relieving IAP inhibition of caspases. To understand Smac-mediated cell death mechanisms, we screened Smac-associated proteins by a yeast two-hybrid method, and I isolated NADE (p75NTR - associated cell death executor) as a Smac-binding protein in vivo. Coimmunoprecipitation and colocalization of Smac and NADE expressed in vivo provide evidence that Smac directly interacts with NADE. This interaction was mapped to the N-terminal region (amino acids 60-75) of Smac and the C-terminal region (amino acids 71-111) of NADE. Interestingly, Smac, NADE, and XIAP can form a ternary complex, and complex formation appears to be required for potentiation of XIAP ubiquitination. Moreover, expression of NADE with Smac enhanced cell death in MCF-7 cells. These results demonstrate that NADE protein interacts with Smac and modulate XIAP ubiquitination and cell death induction.