Synthesis of several glycerol derivatives synthetic studies of tripeptide and tetrapeptide as a caspase inhibitor

Abstract

본 논문은 A, B 두 부분으로 나뉘어져 있다. Part A는 녹용으로부터 추출된 물질 중 조혈모세포 촉진작용과 칼슘이온 분비 활성을 보이는 물질을 직접 합성하고, 그에 따른 여러 가지 glycerol 유도체들을 합성하는 것에 관한 내용을 담고 있으며, part B 에는 세포사멸 과정에서 중추적 역할을 하는 caspase-3의 inhibitor로서 작용하는 tripeptide와 tetrapeptide를 합성하는 내용을 다루고 있다. 녹용은 예로부터 동양 권에서 전통 약재로 사용되어 왔고, 또 최근에 녹용의 추출물이 조혈모세포에서 활성을 나타낸다는 연구결과가 밝혀지기도 하였다. 이에 본 연구에서는 녹용의 활성성분으로 밝혀진 monoacetyldi-glycerides (MADGs)를 여러 가지 생리활성 연구를 위해 대량합성하고, 또한 이를 선도물질로 하여 이와 유사한 glycerolipids 유도체들을 structure activity relationship 연구의 일환으로 디자인하여 합성하였다. MADGs의 합성은 glyceol로 부터 지방산 및 acetic anhydride를 이용하여 일반적인 에스터 형성반응과 acetylation 등의 간단한 방법으로 합성할 수 있었고, 이와 유사한 방법으로 지방산의 구성을 달리한 여러가지 diacetylmonoglycerides (DAMGs)도 합성할 수 있었다. 또한 분자내에 carbamate bond의 형태로nitrogen을 포함하고 있는 물질을 여러가지 지방산들의 isocyanate와 glycerol로 부터 합성할 수 있었다. 또한 분자내에dithiocarbonate group을 도입하여 sulfur를 갖는 물질도 합성하고자 하였으나 이는 실패하였다. 합성한 여러 가지 glycerolipids가 췌장도세포의 칼슘분비에 미치는 영향을 연구한 결과 MADG의 경우에는 새로운 칼슘분비 modulator로서의 가능성을 나타내었고, 다른 물질들은 활성을 보이지 않았다. 또 다른 glycerolipids의 일종인 triacylglyceride는 인간과 동물의 에너지 저정의 일차적 수단이며, 주요 에너지 공급원으로 작용한다. 이들은 주로 유지방의 구성성분으로 알려져 있는데, 최근 bovine udder에서 추출되어 그 구조분석을 위해 짧은 지방산을 가지는 세가지의 TAGs를 합성하였다. 이들 역시 여러 가지 glycerol과 지방산의 에스터 형성반응으로 합성할 수 있었고, 이들의 sodium adducted molecular ion의 CID spectra를 bovine udder에서 추출한TAGs에 적용하여 여러가지 종류의 TAGs를 정확히 구조 분석할 수 있었다. Apoptotic cell suicide는 다세포 유기체의 완전성과 형상성을 유지하기 위해 꼭 필요한 생물학적 과정이다. 그러나 부적절한 세포사멸(apoptosis)은 퇴행성 신경질환이나 암과 같은 대부분의 불치병의 원인이 될 수 있다. Caspase는 이런 apoptotic cell suicide 명령체계에서 가장 중심이 되는 물질로 알려져 있으며, 현재까지 여러 가지 종류의 가역적, 비가역적 inhibitor 들이 연구되고 있다. Part B에서는 지금까지 알려지지 않은 caspase와 inhibitor 간의 interaction 및 mechanism을 규명하기 위해 caspase-3와 가장 잘 결합한다고 알려진 tri- 및 tetrapeptide인 VAD, DEVD를 모티브로 하여 N-terminal에는 fluorescence를 나타내는 p-nitrobenzyl group을, C-terminal에는 irriversible inhibitor로 작용하도록 하기 위해 fluoromethylketone을 도입하기로 하였다. L-Valine 이나 L-aspartic acid에 p-nitrobenzyl를 도입하기위해 carbamate를 형성하였다. 그 후, 펩타이드 결합으로 각각의 di- 또는 tripeptide를 합성하였다. 또한 3-nitropropionyl (4-methoxy) phenyl ester와 Swern oxidation을 거쳐 형성한 2-flurorethanal 의 nitro-aidol condensation을 통해 nitroalcohol을 형성하였고, 이를 Raney-Nickel을 이용하여 amine으로 reduction하였다. 이렇게 얻어진 amino alcohol과 앞에서 합성한 di 또는 tripeptide와 coupling을 한 후, alcohol을 ketone으로 바꾸기 위해 Dess-Martin oxidation을 시도하였으나 원하는 화합물을 아직 얻지 못하였다. Ketone moiety를 가진 화합물을 합성한 후 이를 deprotection하면 원하는 tetra- 및 tripeptide가 완성된다. 합성된 tri- 및 tetrapeptide는 앞으로 laser를 이용한 mechanism 규명에 이용될 것이며, 나아가 Alzheimer s disease와 같은 퇴행성 신경질환이나 암의 치료제로서 개발될 수 있는 가능성이 있다. ; In Part A, monoacetyldiglycerides and its derivatives were synthesized. Deer antler has long been considered as one of the most popular cure-all type traditional Chinese medicines. In recently, monoacetyldiglycerides were discovered to stimulate the proliferation and differentiation of the hematopoietic progenitor/stem cells as well as megakaryocytes. Compared with theses monoacetyldiglycerides, as leading compounds, we synthesized glycerolipids derivatives by modifying fatty acids or introducing heteroatoms on purpose to study structure activity relationships. Monoacetyldiglycerides were synthesized by esterification of glycerol and fatty acids and by acetylation. Diacetylmonoglycerides with variable fatty acids composition were synthesized by a like matter. We also synthesized several compounds containing nitrogen atom in the molecules. These were afforded by carbamate bond formation of isocyanate and alcohol. Monoacetyldiglyceride of the several synthetic glycerolipids showed activity toward Ca2+ release in pancreatic acinar cells, but others showed no activities. Triacylglycerides, another glycerolipids, play an important role in nutrition and other biological process. They are the primary means of energy storage in animals and humans, and their hormonally controlled hydrolysis and oxidation release energy to meet the energy-generation needs of organisms. In this study, we report that the triacylglycerols containing two short-chain fatty acids were first isolated from bovine udder and efficiently synthesized for their structural determination. Three triacylglycerols were afforded by esterification of glycerol and corresponding fatty acids. And structures of the isolated components were completely determined by tandem mass spectrometry coupled with collision-induced dissociation of sodium-adducted molecules desorbed by fast atom bombardment. In Part B, we carried out studies toward the synthesis of tripeptide and tetrapeptide as a caspase inhibitor. Apoptotic cell suicide is a fundamentally important biological process that is required to maintain the integrity and homeostasis of multicellular organisms. Inappropriate apoptosis, however, underlies the aetiology of many of the most intractable of human diseases, including neurodegenerative disorders and cancer. Caspases are at the heart of the highly ordered process of apoptotic cell suicide. Several classes of reversible and irreversible inhibitors have been described for cysteine proteases. In this research, we purpose to characterize the interaction of caspase with tripeptide or tetrapeptide inhibitor by fluorescence resonance energy transfer. Therefore, it is necessary that synthesize the peptide with p-nitrobenzyl group at the N-terminal and fluoromethylketone at the C-terminal. p-Nitrobenzyl group was introduced by formation of carbamate bond at the N-terminal of amino acids using p-nitrobenzyl chloroformate. For the synthesis of target molecules, fuloroethanol was submitted to a Swern oxidation, which was followed by the 3-nitropropionyl (4-methoxy)phenyl ester without isolation of the intermediate fluoroacetaldehyde. Hydrogenation over Raney-Nickel gave amino alcohol, which was converted to precursor of target moleucle by coupling with PNZ-Val-Ala-OH. This precursor was afforded in overall 23% yield via 7 steps. The studies on the synthesis of tripeptide and tetrapeptide are currently under investigation.