Design and development of vectors for efficient molecular manipulation in candida albicans

Abstract

Functional studies on genes of Candida albicans have been hampered by the fact that few vectors are available for efficient cloning and expression in C. albicans in contrast to Saccharomyces cerevisiae. Here six vectors were constructed for molecular manipulation in C. albicans. All of them contained the autonomous replicating sequence ARS 2 and the uracil gene (URA3) as a selective marker. Introduction of multicloning site (MCS) facilitated directional cloning into various convenient restriction sites. Distal to the MCS, the additions of sequence encoding yeast enhanced green fluorescent protein 3 (yEGFP3) and terminator of chitin synthase 2 (TCHS2) enabled us to express an open reading frame (ORF) with its own promoter as a GFP fusion protein so that its intracellular localization could be easily determined. A vector of 7.4 kb was also constructed to express a cloned ORF as a GFP fusion protein under the control of an inducible MET3 promoter (PMET3) located proximal to the MCS. Since this vector was relatively large in size for expressing ORFs, two additional vectors of 6.7 kb were constructed by inserting PMET3 and TCHS2 proximal and distal to the MCS of the above vector containing MCS only, respectively. These six vectors made it possible to study C. albicans in greater detail. They can be used in identification of a promoter, intracellular localization of a protein, and in the induction of lethal genes. ; Candida albicans는 Saccharomyces cerevisiae에 반해 C. albicans의 유전자를 발현시키고 효과적인 유전자 클로닝을 할 수 있는 유용한 벡터가 거의 없어서 C. albicans 유전자에 대한 기능연구가 제한을 받고 있다. 그래서 C. albicans의 분자적인 측면에서 유전자 조작을 할수 있는 6개의 벡터를 만들었다. 이 6개의 벡터는 모두 자동 복제 서열(autonomous replicating sequence (ARS2))과 선택 표지 유전자(selectable marker)인 유라실(uracil) 유전자를 모두 포함하고 있다. 여기에 다중 클로닝 부위(Multi-cloning site)를 도입하여 다양한 제한 효소 부위를 이용하여 양방향 클로닝을 할 수 있게 만들었다. 다중 클로닝 부위 말단에 yEGFP3를 추가하였으며 Chitin synthase 2 의 종결 서열을 넣어줌으로서 자신의 프로모터(promoter)를 가진 유전자가 GFP와 융합하여 발현되어 세포내에서의 위치를 관찰하는데 쉽게 만들어 졌다. 또한 다중 클로닝 부위의 말단에 GFP가 MET3 프로모터의 조절을 받을수 있는 7.4 kb의 벡터를 제작하였다. 이 벡터는 ORFs을 발현시키는데 다소 크기가 클 수 있으므로 2개의 프로모터와 종결서열(TCHS2)를 다중 클로닝 부위에 연결하여 단지 다중 클로닝 부위만 포함하는 6.7 kb의 벡터를 추가하여 만들었다. 이 6개의 벡터들은 C. albicans을 유전자 수준에서 좀더 깊이 있게 연구할 수 있는 가능성을 제공해 줄 수 있다. 이 벡터는 프로모터의 동정. 단백질의 세포내 위치 확인, 치사유전자의 유도에 사용될수 있다.