Parkin as an E3 ubiquitin-protein ligase in drosophila melanogaster

Abstract

약년성 파킨슨씨병은 전세계적으로 알츠하이머 병과 함께 가장 흔한 신경 퇴행성 질환 중의 하나인데 약년성 파킨슨씨병(AR-JP)는 parkin 이라는 유전자에 돌연변이가 생김으로써 Parkin 단백질이 E3 ligase로서의 역할을 못하도록 하여 단백질이 분해되지 못하고 세포안에 쌓임으로써 도파민을 분비하는 세포의 죽음을 유발하는 병이다. 이 실험에서는 초파리(D. melanogaster)에서 parkin 유전자를 분리해내어 그 기능을 밝혀냄으로써 파킨슨씨병 연구에 있어서 초파리의 모델동물로서의 가치를 향상시키는 것에 주 목적을 두었다. 1. 초파리의 parkin 유전자는 다른 동물-human, mouse, rat-들의 밝혀져 있는 parkin 유전자와 염기서열은 30%, 아미노산 서열은 42%의 유사성을 띠고 있으나 Parkin 의 중요한 domain인 RING domain 부분만을 align 해보면 염기서열과 아미노산 서열 둘 다 60%정도의 높은 상동성을 가지는 것으로 조사되었다. 이것은 초파리의 Parkin 단백질도 E3 ligase로서의 역할에서 RING domain 부분이 상당히 중요한 역할을 할 것임을 시사한다. 2. 분리한 Parkin 단백질의 domain별 기능을 알아보기 위해 Parkin을 중요한 domain 으로 나누어 in vitro ubiquitination assay를 실시한 결과 Parkin이 E3 ligase로서의 역할을 하는데 있어 가장 중요한 부분은 RING1 domain 임을 알 수 있었다. 3. 여태까지 파킨슨씨병 환자에게서 밝혀진 Parkin단백질 돌연변이를 PCR-mediated mutagenesis 방법으로 제작하여 in vitro ubiquitination 실험을 한 결과 여태 까지 중요하게 열려졌던 RING domain의 보존 서열인 Cys288이 알려진 만큼 point mutation의 영향을 많이 받지는 않는 것을 볼 수 있었다. 4. Parkin은 E2 ubiquitin conjugated enzyme들 중 UbcH7 그리고 UbcH8과 상호작용을 하는 것으로 열려져 있는데 둘 다 상호작용을 하지만 실험결과 ubch7과 더욱 강한 상호작용을 하는 것을 볼 수 있었다. 이런 실험 결과들로 미루어 볼 때 Parkin은 초파리에서 ubiquitin 의존성 단백질 분해작용기작에 의해 몸속의 필요없는 단백질들을 분해함으로써 몸 속의 단백질의 양을 조절하는 작용을 맡고 있으며 이 기작이 무너지면 세포가 괴사함으로써 파킨슨씨병에 걸리는 것을 알 수 있었다. 아울러 초파리의 파킨슨씨병의 원인인 parkin 단백질에 관한 연구는 초파리와 초파리를 모델동물로 한 사람의 신경계를 이해하는데 커다란 공헌을 할 수 있을 것이다. ; Autosomal recessive juvenile parkinisonim(AR-JP) is one of the most common familial forms of Parkinson disease, and AR-JP is caused by the mutations of the gene encoding a novel protein called Parkin. In this study, Drosophila parkin cDNA clone was isolated and compared. Nucleotide and Amino acid sequence of Parkin has 30%, 42% homology with human, but RING domain has approximately each 60% homology. To identify Parkin of D. melanogaster, domain analysis of Parkin and mutants was performed with E1, E2 (UbcH7, UbcH8) and Ub via in vitro ubiquitination assay. In vitro ubiquitination assay indicated that D. melanogaster Parkin was involved in protein degradation as an E3 ubiquitin-protein ligase, interacting with UbcH7 and UbcH8 and UbcH7 was more efficient. In the result of assay, just RING1 contained deletion mutants had E3 ubiquitin ligase activity, and Lys42Pro, Arg275Trp had loss of E3 ligase activity but Cys288Gly had not loss activity. These results showed that RING1 domain was necessary in activity of Parkin as E3 ubiquitin ligase, and Cys288 do not affect to ligase activity though it was notified as RING domain motif. These results suggested that Parkin function as an E3 ubiquitin-protein ligase through its RING domain and that it may control protein levels via ubiquitination dependent proteolytic pathway in D. melanogaster. The availability of the D. melanogaster Parkin and the initial elucidation of its distribution should facilitate further research on the pathophysiological role of Parkin in the nervous system.