냉동 조혈세포의 해동 후 시간경과에 따른 세포고사 및 세포생존력 변화

Abstract

냉동 조혈세포는 해동 후 점차 시간이 지나면서 세포 고사 및 세포사가 일어나고 세포 생존력이 감소되므로 해동 후 가능한 빨리 환자에게 주입하는 것이 가장 이상적이다. 그러나 냉동보존제의 제거나 거리상의 문제 등으로 즉시 주입이 어려울 경우가 있다. 이에 저자는 냉동 조혈모세포의 해동 후 시간 경과에 따른 세포 고사와 생존력의 변화를 관찰하고 해동 후의 냉동 조혈모세포의 사용 지침을 제시하고자 하였다. 자가 말초혈 조혈모세포 이식을 위해 냉동 보존하였던 가동화된 말초혈을 이용하였다. 37℃ 수조에서 해동시키고 해동 직후 검체를 trypan blue로 염색하여 세포 생존율을 구하였다. 또한 해동 직후와 해동 후 1, 2, 4 및 24 시간이 지난 각 검체를 methylcellulose배지에 10일간 배양하여 집락 형성 수를 비교하였다. annexin V와 7-aminoactinomycin D (7-AAD)로 염색한 후 유세포 분석으로 전체 세포와 이 세포 중 CD34^+ 세포만을 선택해서 각각 생존 세포, 고사세포 및 사세포로 나누어 시간 경과에 따른 변화를 비교하였다. 해동 직후의 단핵 세포의 생존율은 77.3±10.8% 였으며 2×105 세포 주입 후 집락 형성 세포수는 해동 직후 199.2±120.6개이었고 해동 1, 2, 4 및 24 시간 후는 각각 127.3±38.8개(63.9%), 100.0±28.8개(50.2%), 91.2±19.9개(45.8%), 23.2±17.4개(11.6%)로 감소하였다. 해동 후 시간 경과에 따른 CD34^+ 세포 중의 고사된 세포의 비율은 해동 직후는 0.2%이었으나 해동 1, 2 시간 후에는 각각 16.5%, 21.9%로 유의한 증가를 보이다가 해동 4, 24 시간 후에는 각각 15.0%, 2.7%로 감소하는 반면 사세포의 비율은 해동 직후와 1 시간, 2 시간에서는 18.0%, 14.7%, 7.2%로 감소하다가 4 시간에는 17.8%로 증가되기 시작하여 해동 24 시간에는 55.3%로 증가된 소견을 보였다. 즉, CD34^+ 세포는 해동 후 2 시간이 경과되면 고사 세포에서 사세포로 변화가 증가되는 것을 알 수 있다. 조혈모세포 이식시 이용되는 해동된 냉동 조혈모세포는 1 시간이 지나면서부터 상당한 세포고사가 진행되어 자기 복제 및 집락 형성 능력이 감소하기 시작하고 사세포로 대치되기 시작하였다. 따라서 세포고사를 고려한다면 조혈모세포는 해동 후 적어도 1 시간 이내에 환자에게 주입하는 것이 바람직하다고 하겠다. ; Thawed stem cells should be infused as early as possible because delay of infusion leads to decrease of cell viability and formation of DNA clumping. The procedure to remove Dimethyl sulfoxide (DMSO) and long distance from thawing place to patient are the main causes of delay of infusion, while result in the loss of cell viability and apoptosis. Therefore, we investigated the changes of cell viability and apoptosis after thawing with lapse of the time. Five samples of mobilized peripheral blood were evaluated. We measured cell viability, colony forming unit (CFU) and apoptosis at 0, 1, 2, 4, and 24 hours after thawing. Cell viability was counted by trypan blue elution test. CFUs were observed in methylcellulose media at 10 day of culture. The state of stem cells were divided into live, apoptotic and dead with double staining using annexin V and 7-aminoactinomycin D (7-AAD) in flow cytometry. 1) Viability of the total cells after thawing was 77.3±10.8%. 2) CD34^+ cells were decreased from 1 hour and remained only 24.0% of initial cell count at 24 hours after thawing. 3) The recovered percentage to initial CFU at 1, 2, 4 and 24 hours after thawing were decreased to 63.9%, 50.2%, 45.8% and 11.6%, respectively. 4) The proportion of apoptotic cells among CD34^+ cells after thawing were increased from 0.2% at 0 hour to 16.5% at 1 hour, 21.9% at 2 hours, and then decreased to 15.0% at 4 hours, 2.7% at 24 hours because they were replaced by dead cells. Thawed cells were changed to apoptotic and had less colony forming capacity from 1 hour after thawing, and then were replaced by dead cells from 4 hours after thawing. So thawed stem cells were infused to patient as soon as possible.