Isolation and characterization of cold responsive genes in Arabidopsis by suppression subtractive hybridization

Abstract

식물은 이동성이 결여 되어 있으므로 인해 환경 적응 방법이 다른 생물 종보다 더 정교하게 발전되었을 것으로 생각된다. 특히 다양한 환경 조건 중에서 저온 스트레스는 식물의 생육 및 번식에 결정적 요인으로 작용하므로 식물은 진화를 통해 이를 극복하거나 적응하는 형태적, 생리학적, 생화학적 기작을 발전시켜 왔다. 식물이 결빙온도가 아닌 저온의 환경조건을 감지하여 이에 반응하는 것을 저온순화(cold acclimation)라고 한다. 1985년 Guy 등에 의해 저온 순화 시 저온에 의하여 유전자 발현에 변화가 있음이 확인된 이래, 저온 유도성 유전자의 분리 및 이들의 내동성 기작 에서의 역할에 대한 연구가 활발하게 진행되어 왔다. 그 연구의 결과, 저온순화 시 발현이 유도되는 많은 수의 유전자들이 잠재적으로 내동성에 기여하는 효소활성과 연관되어 있음을 알 수 있었다. 따라서 이러한 연구는 식물의 내동성 및 저온 내성에 대한 이해를 바탕으로 경제적으로 유용한 작물들의 내성 증진을 위한 육종에 큰 진전을 유도할 것으로 기대된다. 본 논문에서는 suppression subtractive hybridization (SSH) 방법을 이용하여 저온 처리군과 대조군 사이에서 차등 발현되는 유전자들을 분리, 동정 하고자 하였다. Subtraction library 중에서 무작위로 추출된 490개의 clone에 대해 reverse northern blot 분석을 수행한 결과, 29.18% 인 143 개의 clone이 저온에 의해 발현 정도가 증가됨을 확인 할 수 있었다. 이 중 20개의 clone에 대해 염기서열 분석을 수행하고 database를 검색하여 유전자의 기능을 추론하였다. 20 개의 clone에는 14 개의 유전자가 포함되었으며 이 중 4 개는 novel한 유전자 였고 5개는 저온에 의해 유도됨이 이미 알려져 있는 유전자 였다. 나머지 5개의 유전자는 기능만이 알려져 있을 뿐 저온과 연관된 보고는 아직 없었다. 염기서열이 분석된 유전자 중 몇 종류에 대해 northern blot 분석과 RT-PCR을 통해 이들 유전자가 저온에 의해 발현이 유도됨을 확인하였다. 본 연구는 저온에 의해 발현이 유도되는 유전자를 분리하고 그 특성을 분석하여 저온에 대한 내성 기작을 이해함으로써, 식물의 저온 저항성을 향상 시키는 기반 지식으로써 활용 될 수 있을 것이다. ; Many plant species are able to increase their cold tolerance after being exposed to low temperatures. This adaptive process, known as cold acclimation, involves a number of biochemical and physiological changes. Acclimation causes accumulation of cryoprotectants, including soluble sugars, proline, polyamines, changes in enzyme activities, physical and biological restructuring of cell membranes through changes in the lipid composition, and induction of other nonenzymatic proteins. Many of these changes have been shown to be regulated through changes in gene expression. To investigate the changes of gene expression after cold stress in Arabidopsis, suppression subtractive hybridization (SSH) was performed using control and cold treated Arabidopsis. Through SSH technique, enriched-cold responsive genes were inserted into pZErO™-2 vector, and subtracted library for cold responsive genes was constructed. To exclude false signal and isolate cold regulated clones, reverse northern blot analysis was carried out with randomly selected 490 clones. As a result, 143 clones (29.18%) were cold inducible out of 490 clones. The insert from these 20 out of 143 positive clones were sequenced using T7 primer, and the homology searches were performed by the BLAST program at NCBI and AtDB. Of the 20 clones, 4 clones represented novel genes that showed no significant homology with any functionally annotated sequences in the public databases. Some of the clones that the function is annotated, were reported cold inducible genes - COR15a (cold- regulated 15a), COR15b, ELIP (early-light inducible protein) gene, EF1-α (elongation factor 1 alpha), and ferritin. For further target validation, northern analysis and RT-PCR were applied. The induction of HS2 (ELIP), HS375 (NAP57), and HS399 (COR15a) was confirmed, and HS375 (NAP57) has not previously been reported as a cold inducible gene. In the case of novel clone HS186, RT-PCR was performed and the induction of HS186 in cold stress is confirmed. Further studies to determine the modes of action of these cold-induced genes are critical to understanding of cold tolerance mechanisms. Moreover, these studies should contribute to fundamental knowledge of how plants improve cold tolerance and potentially provide tools that can be used to design more cold-resistant plants.