Studies on the functions of the interacting domain between chitin synthase 3 and chitin synthase 4 of saccharomyces cerevisiae

Abstract

Saccharomyces cerevisiae에서 각 chitin synthase간의 서로 다른 세포내 기능에 대한 집중적인 연구에 의해 각 효소의 활성은 공간적, 시간적으로 조절되어야 한다는 것이 제시되었다. 영양 세포 주기동안 chitin synthase 3에 의한 chitin 합성은 chitin synthase 4에 의해 조절된다고 알려져 있다. 이전 연구에서 yeast two-hybrid system을 이용하여, Chs4p와 상호 작용하는 Chs3p 의 한 부위를 동정하였는데, 54개의 아미노산을 포함하는 이 부위를 MIRC3-4라 명명하게 되었다. MIRC3-4내에서 일어난 몇몇 돌연변이 균주가 효소 활성과 chitin활량이 감소됨을 보여 주었다. 더욱이 단백질간 상호 작용 조사에서 Chs4p와 약한 상호작용을 나타냈다. 종합하여 Chs4p와 상호작용에 영향을 주는 핵심적인 부분을 규명하게 되었다. 또한 Calcofluor 염색법과 immunofluorescence를 통해 세포 주기에서 G1기와 cytokinesis시기에 MIRC3-4의 역할을 조사하였다. 몇몇 돌연변이들은 초기 G1기에 chitin ring이 사라지지만 cytokinesis시기에 세포벽의 합성에는 영향을 받지 않았음을 보여 주었다. chs4 돌연변이 균주에서 chitin 분포로 보아 CHS4는 G1기의 chitin ring 합성과 cytokinesis후에 세포벽을 합성하는 chitin synthase 3 활성을 조절함을 암시해 준다. Chitin ring이 존재하지 않는 것은 Chs3p가 제대로 자리를 잡지 못했거나 Chs4p와 충분한 상호작용이 없어서일 수 있다. 이 두가지 가능성을 구별하기 위해 돌연변이 균주를 Chs3p에 특이적으로 결합하는 항체를 가지고 염색했을 때 모든 MIRC3-4 돌연변이 균주들이 제대로 자기 위치에 자리 잡았음을 볼 수 있었다. 이는 Chs4p가 recruiter라기 보다는 activator로서 Chs3p의 활성을 조절한다는 것을 제시한다. ;In Saccharomyces cerevisiae, extensive studies on the different cellular function of each chitin synthase suggested that the activity of each enzyme must be spatially and temporally regulated. It has been proposed that chitin synthase 3-mediated chitin synthesis during the vegetative cell cycle is regulated by chitin synthase 4. Previously, a domain of Chs3p that is responsible for interaction with Chs4p was identified, using the yeast two-hybrid system. This domain of 54 amino acids, termed MIRC3-4 (Maximum Interacting Region of Chs3p with Chs4p). Some mutations in MIRC3-4 showed in a decrease in the enzymatic activity and chitin contents. Moreover, Chs3p carrying those mutations exhibited weak interactions with Chs4p when assayed by the yeast two-hybrid system. Synthetically, a core region in MIRC3-4 that affects the interaction with Chs4p was defined. Further, the functional roles of MIRC3-4 were examined at G1 phase and cytokinesis of the cell cycle by Calcofluor staining and immunofluorescence. Some mutations in MIRC3-4 resulted in disappearance of chitin ring in the early G1 phase, but did not affect chitin synthesis in the cell wall at cytokinesis. The chitin distribution in chs4 mutant cells indicated that CHS4 is involved in the synthesis of chitin ring in the G1 phase and cell wall chitin after cytokinesis, suggesting that Chs4p regulate chitin synthase 3 activity in different ways in G1 and cytokinesis. Absence of chitin ring could be caused either by delocalization of Chs3p to the bud neck or by insufficient interaction with Chs4p. When mutant cells were immunostained with Chs3p-specific antibody to distinguish between those two alternatives, the mutated Chs3p was found to localize to the bud neck in all MIRC3-4 mutants. These results strongly suggest that Chs4p regulate Chs3p as an activator not a recruiter.