사람 제대혈 CD34 양성 세포의 체외증폭과정에서 거핵구계열 세포분화에 관한 연구

Abstract

최근 제대혈 이식이 골수이식을 대체할 수 이는 조혈모세포 이식 방법으로 각광을 받고 있다. 제대혈은 채취가 용이하고 저장이 가능할 뿐 아니라 이식편대숙주병의 빈도가 낮은 장점이 있지만, 제대혈 속에 포함된 조혈모세포의 수가 적고 면역학적으로 더 미성숙하기 때문에 생착에 걸리는 기간이 길며, 특히 혈소판의 회복이 느리다. 성인을 대상으로한 이식이 보편화되기 위해서는 조혈모세포의 수를 증가시키는 방법의 하나로 조혈성장인자를 이용한 체외증폭(ex vivo expansion)이 필요하다. 체외증폭과정에서 조혈모세포의 증폭과 함께 분화가 일어나는데, 분화 과정에 관한 연구는 아직 잘 안되어 있다. 본 연구에서는 효과적인 증폭방법으로 알려진 thrombopoietin(TPO), flt3-ligand(FL) 및 granulocyte-colony stimulating factor(G-CSF)를 사용한 액체배양 방법으로 제대혈 조혈모세포를 체외증폭시키는 과정중 거핵구계열 세포분화 과정을 알아보고자 거핵구계열 표지와 apoptosis의 변화 및 형태학적 분화를 관찰하였다. 연구방법은 만삭분만시 채취한 제대혈로부터 CD34 양성 세포를 분리하였고(순도 > 95%) TPO, FL 및 G-CSF를 조합하여 첨가한 액체배지에 5x104 cell/mL의 농도로 4주까지 배양하였다. 거핵구계열의 표지인 GPIII(CD61), GPIIb/IIIa(CD41) 및 GPIb(CD42b)의 발현 변화를 유세포분석기로 측정하였고 7-aminoactinomycin D(7-AAD) 염색을 이용하여 apoptosis를 측정함과 동시에 삼파장 유세포분석기를 이용하여 거핵구계열 표지와의 연관성을 알아보았다. 각 시기에 cytospin을 제작하고 Wright 염색, PAS 염색 및 dual esterase 염색으로 형태학적 분화를 관찰하였다. 연구결과는 다음과 같았다. 1. 세포의 수는 TPO + FL, FL + G-CSF, 및 TPO + FL + G-CSF를 첨가하였을 때 모두 효과적으로 증가하였다. 2. GPIII, GPIIb/IIIa 및 GPIb를 발현하는 세포는 TPO가 포함된 경우에만 배양 4일부터 2주까지 출현하였는데 최고점은 11일째였다. 3. 형태학적으로도 TPO가 첨가된 경우에 배양 4일에서 2주에 걸쳐 핵이 두개인 미성숙 거핵구가 소수 출현하여 11일째에 최고를 보였으며 성숙 거핵구 및 혈소판 생성은 관찰되지 않았다. 4. 세포질 bleb이 있고 핵이 한쪽으로 치우친 미성숙 세포들이 TPO가 첨가된 경우에만 배양 4일부터 17일째에 관찰되었고 최고점은 11일째였으며 TPO에 의해 나타나는 apoptotic 세포들로 추정되었다. 5. 세포질에 bleb이 있는 미성숙 세포들은 형태학적으로 분화되지 않아 명확한 계열 구분이 어려웠으나,PAS 염색에서 점상으로 양성이었고 nonspecific esterase 염색은 세포질의 한쪽에 양성인 소견을 보여 거핵구계열 세포의 특수염색 양상과 일치하였다. 6. TPO는 배양 4일에서 2주에 걸쳐 전체 세포의 50% 정도에서 apoptosis를 유발함이 알려져 있는데 7-AAD와 동시에 염색하여 이들 apoptotic 세포들이 GPIII, GPIIb/IIIa 및 GPIb를 발현하는 세포에서 출현함을 확인하였다. 본 연구에서 제대혈 CD34 양성 세포를 체외증폭할 때 TPO를 첨가하면 거핵구계열 세포가 출현하였고 그 최고점은 배양 11일째였으며 이들 미성숙 거핵구계열 세포는 apoptosis로 진행되었다. 또한 TPO에 의한 거핵구계열로의 세포분화에 FL이나 G-CSF가 길항작용을 나타내지 않았다. 따라서 TPO, FL 및 G-CSF를 병행함으로써 체외증폭의 상승작용과 더불어 거핵구계열 세포의 분화를 유도할 수 있음을 알 수 있었다. ; Human umbilical cord blood(CB) dells are an alternative source of hematopoietic stem cells(HSCs) for allogeneic bone marrow transplantation. However, the use of CB is limited by a delayed engraftment due to insufficient number of HSCs. Cytokine-mediated ex vivo expansion has been proposed as a means of increasing the number of CB HSCs for transplantation. As HSCs are self-renewing and differentiating constantly, some differentiated cells should be produced during ex vivo expansion. Meanwhile, prolonged thrombocytopenia resulting from inadequate megakaryocte(MK) progenitor cell is one of the serious problems after high-dose chemotherapy followed by transplantation. In this situation, infusion of MK progenitors that are expanded ex vivo could be clinically benificial. In this study, we investigated the ability to generate MK progenitors during ex vivo expansion of CB CD34+ cells using thrombopoietin(TPO), flt3-ligand(FL), and granulocyte-colony stimulating factor(G-CSF). CD34+ cell isolated from four human cord blood were cultured in a stroma-free liquid culture system using TPO, FL, and/or G-CSF. During ex vivo expansion which was up to four weeks, surface phenotypes of cultured cells including CD34, CD61(GPIII), CD41(GPIIb/IIIa), and CD42b(GPIb) were investigated by flow cytometry, along with simultaneous measurement of apoptosis by 7-aminoactinomycin D staining method. At the same time, morphologic differentiation was studied by cytospin preparation with Wright stain, PAS stain and the dual esterase stain. Total viable cells increased continuously in the culture with the cytokines until the 4th week. TPO, FL, and G-CSF were synergistic for expansion of total cells. The megakaryocytic cells with CD61, CD41, and CD42b expression appeared in the culture with TPO from the 4th day to the 2nd week of culture. The maximum expression of these markers was observed on the 11th day of culture. TPO also induced apoptosis during this period, and these apoptotic cells were generated from CD34-CD61+, CD34-CD41+, and CD34-CD42b+ fractions. Morphologically, the majority of the cells were poorly differentiated mononuclear cells with increased cytoplasm until the 2nd week of culture, except a few binuclear cells with large cytoplasmic volume even in the presence of TPO. Mature megakaryocytes and proplatelet displaying megakaryocytes were not observed. Some immature cells with cytoplasmic bleb, which were suggested as apoptotic cells appeared in the cultures with TPO from the 4th day to the 17th day of culture. These cells were positive for the PAS stain in block pattern and were also positive for nonspecific esterase, which suggests megakaryocytic lineage. In conclusion, during the ex vivo expansion of human cord blood CD34+ cell using TPO, FL, and G-CSF, TPO is able to induce megakaryocytic differentiation. MK progenitors generated ex vivo in this study were suggested to undergo apoptosis. Morpholoically, those cells were not fully differentiated. CD34+GP+ MK progenitors may be an appropriate cell population for transplantation for the prophylaxis of prolonged thrombocytopenia after transplantation. The efficacy of this procedure will be tested prospectively in a clinical trial.