Adenosine이 각질형성세포주 HaCaT 세포에서의 ICAM-1발현에 미치는 영향

Abstract

Intercellular adhesion molecule(ICAM)-1 is a transmembrane protein belonging to the immunoglobulin superfamily and mediates cell to cell adhesion by acting as a receptor for leukocyte surface antigen. ICAM-1 is present in low levels on the surface of epidermal keratinocytes, but its expression is enhanced by IFN-g, TNF-a, IL-1a and ultraviolet radiation etc. This ligand induction promotes leukocyte attachment to keratinocytes and is probably crucial in cytotoxic damage to keratinocytes. Increased ICAM-1 expression was observed in chronic inflammatory skin disease, such as psoriasis, atopic dermatitis and allergic contact dermatitis. Adenosine is an endogenous purine nucleoside released by cells. During ischemia or hypoxia, massive ATP degradation increases the local adenosine concentration, at these concentration, adenosine is likely to play a role in limiting tissue injury upon reperfusion or reoxigenation. Adenosine appears to be the chemical signal that inhibits the inflammatory system from injuring viable tissue near necrotic cells. Recently the studies about antiinflammatory effects of adenosine in various tissues were increased, but there is few studies about the effect of adenosine on epidermal keratinocytes. We investigated the effects of adenosine on ICAM-1 expression in cultured human keratinocyte cell line HaCaT cells by cell-ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) & FACS(fluorescence-activated cell sorter) analysis. The results are summerized as follows: 1. ICAM-1 expression was significantly increased by IFN-g (500U/ml), IFN-g & TNF-a(10-8M) and IFN-g & LPS(10-8M)(p<0.05), but not by TNF-a, LPS and TNF-a & LPS. 2. Incubation of HaCaT cells with IFN-g (1-2000U/ml) for 48 h induced dose-dependent expression of ICAM-1 at above 500U/ml of IFN-g . 3. Adenosine had no effects on ICAM-1 expression of unstimulated cells. 4. Adenosine(esp. 10-4M) significantly inhibited ICAM-1 expression of cells stimulated by IFN-g (p<0.01) and this effects was confirmed by FACS method. 5. Adenosine(10-4M) significantly inhibited ICAM-1 expression of cells stimulated by IFN-g (p <0.01), IFN-g & TNF-a(p<0.05) and IFN-g & LPS. 6. The inhibition of ICAM-1 expression was not observed when cells were preincubated with an adenosine A1 receptor agonist(R-PIA) or an adenosine A2 receptor agonist(NECA). 7. The inhibition of ICAM-1 expression of adenosine was not affected by pretreatment state with an adenosine A1 & A2 receptor antagonist(theophylline)(p < 0.01). 8. The inhibition of ICAM-1 expression of adenosine was not observed by pretreatment state with an inhibitor of adenosine cellular uptake(dipyridamole). In conclusion, high concentration of adenosine inhibits enhanced ICAM-1 expression by stimulated HaCaT cells and these inhibitory effects of adenosine are mediated through other adenosine receptors expect adenosine A1 and A2 receptors. And we suggest that there may be unknown intracellular mechanism about inhibition of ICAM-1 expression via intracellular-uptaken adenosine. ; 세포접착분자(adhesion molecules)는 세포표면에 염증관련세포들이 부착하게하여 여러가지 면역반응과 염증반응이 생길 수 있도록 하는 물질로 다양한 세포에서 발현된다. 이들 세포접착분자들중에서 intercellular adhesion molecule(ICAM)-1은 immunoglobulin superfamily에 속하는 transmembrane glycoprotein으로 피부 각질형성세포의 표면에 발현하여 백혈구 표면에 발현하는 lymphocyte function-associated antigen-1(LFA-1)과 연결 물질로 작용하며, 정상 각질형성세포에서도 소량 발현되나 IFN-g, TNF-a 및 UVB같은 여러 자극에 의해 피부각질형성세포에서 발현이 증가되며 건선, 아토피 피부염, 접촉성 피부염 같은 만성 피부질환에서 ICAM-1발현의 증가를 관찰할 수 있다. Adenosine은 염증반응의 조절 역할을 하는 내인성 항염증 물질로 adenosine 수용체와 상호작용을 통해 호중구에서 독성 산소 유리기(toxic oxygen radicals)유리, 식작용 및 혈관내피세포와 유착 등을 억제해서 호중구매개성 조직손상을 억제하며 TNF-a, IL-6 및 IL-8 생산을 억제하고, 말초혈액 단핵구에서 강력한 항염증 사이토카인인 IL-10의 생산을 촉진시키는 등 여러가지 염증반응과 면역반응에 작용한다. 최근 여러조직에서 adenosine의 항염증효과에 관한 연구가 증가하고 있으나 피부 각질형성세포에서 adenosine의 영향에 대한 면역학적 연구는 매우 적다. 이에 연구자는 내인성 항염증물질인 adenosine이 각질형성세포주 HaCaT 세포에서 ICAM-1 발현에 미치는 영향을 알아보고자 이 연구를 시행하였다. HaCaT 세포를 배양한 후 각종 ICAM-1 발현 자극 물질(IFN-g, TNF-a,LPS)로 자극하여 ICAM-1발현량을 관찰하였고, 그후 자극물질에 의해 증가된 ICAM-1 발현이 adenosine, adenosine A1 수용체 작동제(adenosine A1 receptor agonist, R-PIA)와 A2 수용체 작도에(adenosine A2 receptor agonist, NECA), adenosine A1과 A2 수용체 길항제(adesnosine A1 & A2 receptor antagonist, theophylline) 및 adenosine의 세포내 흡수억제제(dipyridamole) 첨가에 의해 어떤 변화가 있는지 세포-ELISA(cell enzyme-linked immunosornebt assay)와 유세포분석기(FACS, fluorescence-activated cell sorter)로 측정하여, 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. HaCaT 세포에서 ICAM-1 발현은 IFN-g(500U/ml) 단독자극, IFN-g 와 TNF-a(10-8M) 및 IFN-g와 LPS(10-8M)의 혼합자극시 유의하게 증가되었으나(p<0.05), TNF-a와 LPS의 단독 및 혼합자극시에는 유의하게 증가하지 않았다. 2. IFN-g농도에 따르는 ICAM-1 발현은 IFN-g 500U/ml 이상에서 IFN-g농도의 증가에 비례하여 증가였다. 3. 자극하지 않은 상태에서 HaCaT 세포에서 ICAM-1 발현에 미치는 adenosine의 영향은 adenosine 농도가 증가함에 따라 ICAM-1 발현이 다소 증가하였으나 유의상은 없었다. 4. IFN-g (500U/ml)로 자극한후 adenosine 10-8M, 10-6M 및 10-4M 농도별로 첨가시 세가지 농도에서 유의하게 ICAM-1 발현증가가 억제되었으며(p<0.05),이중 adenosine 10-4m농도에서 ICAM-1 발현증가가 가장 현저하게 억제됨을 보였다.(p<0.01) 또한 IFN-g 500U/ml와 adenosine 10-4M을 첨가하여 ICAM-1발현을 유세포 계측기로 측정한 결과 IFN-g에 의해 증가된 평균형광강도(mean fluorescence intensity, MFI)가 adenosine 10-4M 첨가로 감소됨을 보여 adenosine이 ICAM-1 발현증가를 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 5. Adenosine(10-4M)의 ICAM-1 발현증가에 대한 억제효과는 IFN-g 단독으로 자극했을 때 뿐아니라 IFN-g 와 TNF-a, IFN-g 와LPS의 혼합자극한 후에서도 관찰할 수 있었다. 6. IFN-g (500U/ml)로 자극후 adenosine A1 수용체 작동제(R-PIA 10-4M)와 A2 수용체 작동제(NECA 10-4M)를 첨가시 ICAM-1 발현증가에 억제효과를 나타내지 않았다. 7. Adenosine 10-4M과 adenosine A1과 A2 수용체 길항제(theophylline 10-4M)로 전처치한 후 IFN-g (500U/ml)로 자극하여 ICAM-1 발현을 측정한 결과 유의하게 ICAM-1 발현증가를 억제하는 것을 관찰할 수 있었으며(p<0.01) 이에 따라 theophylline이 adenosine의 ICAM-1발현증가를 억제하는 작용에 영향을 미치지 못하는 것을 관찰할 수 있었다. 8. Adenosine 10-4M과 세포내 흡수억제제(dipyridamole 10-4M)의 전처치한 후 IFN-g (500U/ml)로 자극하여 ICAM-1 발현을 측정한 결과 adenosine의 ICAM-1 발현증가에 대한 억제효과를 관찰 할 수 없었다. 이상의 결과로 고농도의 adenosine은 각질형성세포주 HaCaT세포에서 ICAM-1 발현증가를 억제하였으며, adenosine A1과 A2 수용체 작동제(R-PIA, NECA)가 IFN-g 에 의한 ICAM-1 발현증가에 영향을 미치지 않았고, adenosine A1 과 A2 수용체 길항제(theophylline)가 adenosine의 IFN-g 에 의한 ICAM-1 발현증가 억제에 영향을 미치지 못했다는 점으로 HaCaT 세포에서 adenosine의 ICAM-1 발현증가에 대한 억제효과는 adenosine A1, A2 수용체 이외의 다른 adenosine 수용체가 작용할 것으로 생각된다. 또 adenosine의 세포내 흡수억제제(dipyridamole)로 adenosine의 ICAM-1 발현증가에 대한 억제효과를 관찰 할 수 없는 점으로 보아 지금까지 잘 알려져 있지않은 세포내로 흡수된 adenosine에 의한 ICAM-1 발현증가의 억제기전이 존재할 가능성이 있을 것으로 생각된다.