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Saccharomyces cerevisiae 와 Candida albicans에서 chitin 합성효소의 조절 기작과 생리학적 역할 : Studies on the regulating mechanisms and physiological roles of chitin synthases of saccharomtces cerevisiae and candida albicans

Title
Saccharomyces cerevisiae 와 Candida albicans에서 chitin 합성효소의 조절 기작과 생리학적 역할 : Studies on the regulating mechanisms and physiological roles of chitin synthases of saccharomtces cerevisiae and candida albicans
Authors
박현숙
Issue Date
2002
Department/Major
대학원 생물과학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Doctor
Abstract
곰팡이의 세포벽을 구성하는 chitin 합성효소는 세포 내에서 여러 동위효소로 존재하며, 세포주기와 발달 단계에 따라 특정한 시기에 매우 분화된 기능을 수행한다. 따라서 chitin 합성효소의 조절 기작은 매우 중요하게 생각되고 있다. 현재까지 알려진 chitin 합성효소의 조절 인자들은 전사 단계나 번역 후 단계에서 chitin 합성효소의 기능을 조절하는 역할을 담당한다. Saccharomyces cerevisiae에 존재하는 chitin 합성 효소 중 Chs3p는, cell wall chitin과 chitin ring을 합성하며, CHS4가 조절 인자로 규명되어 있다. 본 연구에서는 CHS4가 CHS3와의 단백질 수준의 상호작용에 의해 CHS3의 기능을 조절한다는 기존의 보고에 근거하여, Chs4p와 직접 상호 작용하는 Chs3p의 부분을 규명하고, 이 부분을 MIRC3-4라 명명하였다. MIRC3-4 부분은 50개의 아미노산 서열을 포함하며, 다른 여러 종류의 곰팡이에서 CHS3 homolog 간에 유사성이 매우 높은 것으로 조사되었다. 보존율이 높은 14개의 아미노산을 대상으로 PCR을 이용하여 아미노산을 치환한 결과, 이중 일부 아미노산이 치환된 돌연변이 균주 (M3?9, and M 13)의 in vitro 효소 활성도가 정상인 균주에 비해 최고 90% 이상까지 감소하는 것을 관찰하였으며, 세포벽에 존재하는 chitin의 양도 효소 활성도와 비례하여 감소되는 것을 확인하였다. 그러나 항진균 성분인 calcofluor에 대한 민감성은 모든 돌연변이 균주에서 비슷하게 나타났다. 효소 활성도와 세포 내 chitin 양의 변화에 의해 세포 내의 chitin 분포 정도가 영향을 받을 것으로 예상하고, calcofluor 염색법으로 확인한 결과, 효소 활성도가 낮은 균주들에서 chitin ring이 합성되지 못함을 확인하였다. 그러나 모든 돌연변이 균주에서 cytokinesis 이후의 딸세포 세포벽에 형성되는 cell wall chitin의 합성은 영향을 받지 않았다. 그러므로 MIRC3-4 부분이 G1 기에 chitin ring 합성에만 관계되는 부분임을 알 수 있다. 돌연변이에 의해 chitin ring 을 형성하지 못하게 된 균주는 Chs4p 와의 단백질 간 상호작용의 세기도 약화됨을 two hybrid assay를 통해 밝혀내었다. 그러므로 이 부위가 Chs4p와의 직접적인 상호작용에 의해 Chs3p의 기능을 조절하는 부분으로 생각된다. 이전의 연구에서 CHS4는 Chs3p의 localization과 conformation에 관여할 것이라는 보고가 있었으므로, immunofluorescence assay를 수행하여 이를 확인하였다. 모든 돌연변이 균주에서 Chs3p는 세포주기에 따라 정상 균주와 동일하게 localization pattern을 보이는 것으로 미루어, Chs4p는 Chs3p의 recruiter라기 보다는 activator로서, MIRC3-4 부분과의 단백질 수준의 상호작용을 통하여 chitin ring 합성을 조절함을 알 수 있다. Chitin 합성은 병원성 곰팡이인 Candida albicans의 형태 전환에 중요한 요인이므로, chitin 합성효소에 대한 저해제의 작용조건에 대하여 조사하는 것은 중요한 일이다. Nikkomycin Z는 chitin synthase에 대한 경쟁적 저해자 (competitive inhibitor)로서, Saccharomyces cerevisiae 의 세 chitin 합성효소 중 Chs1 과 Chs3를 선택적으로 저해하는 것으로 알려졌다. 본 연구에서는 in vitro 효소 활성도 측정법을 이용하여 Candida albicans 의 chitin 합성효소에 대한 nikkomycin Z의 저해효과를 조사한 결과, 세 chitin 합성효소 모두를 저해함을 확인하였다. IC_50 값은 CaChs1에 대해서는15 μM, CaChs2는 0.8 μM, CaChs3는 13 μM인 것으로 조사되었다. 결과적으로 nikkomycin Z는 S. cerevisiae와 C. albicans에서 chitin 합성효소에 대한 저해도의 차이를 보이며, 이것은 두 organism에서 chitin 합성효소의 기능의 차이와도 연관된다. Nikkomycin Z는 in vivo에서도 배지조건에 따라 C. albicans의 생장과 균사체 형태전환을 다르게 저해하는 양상을 보였다. 균사체 형성을 유도하는 Spider media, corn meal agar, Lee s media에서 각각 Nikkomycin Z의 저해효과를 조사한 결과, Lee s media 에서는 C. albicans의 생장을 거의 저해하지 못하였다. 이와 같은 Nikkomycin Z에 의한 생장도 저해효과는 in vivo 에서 nikkomycin Z가 chitin 합성효소의 활성도를 저해한 결과로부터 기인하는 것임을 calcofluor staining을 통하여 확인할 수 있었다. spider 배지와cornmeal agar 배지에서 nikkomycin Z에 의해 생장도가 저해된 균주들은 septum과 cell wall chitin 의 형성이 저해된 것을 확인할 수 있었다. 특히 CaChs1 의 활성도만 가지고 있는 돌연변이 균주에서는 격벽이 없는 사슬모양의 비정상적인 형태와 세포의 용혈현상도 관찰되었으며, 이러한 현상은 sorbitol을 첨가한 경우 다소 감소하였다. 그러므로 세포 내에서 nikkomycin Z에 의한 chitin 합성효소의 저해와 그로 인한 세포 생장 저해와 용혈현상은 배지 조성에 의한 영향을 받는다고 볼 수 있다. 또한 CaChs1 은 C. albicans에서 세포의 형태를 보존하는 기능을 가지도록 분화되었음을 알 수 있다. Key words: chitin synthase 3, chitin ring, cell wall chitin, ScCHS4, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, chitin synthase, septum formation, nikkomycin Z, media composition. ; The existence of three different chitin synthases (Chitin synthase 1, 2, and 3) with specific roles during the yeast life cycle suggests that specific their enzymatic regulation should be well modulated. It has been proposed that chitin synthase3-mediated chitin synthesis during the vegetative cell cycle is governed by a regulator encoded by CHS4. To investigate direct protein-protein interaction between their coding products, Chs3p and Chs4p, a domain of Chs3p that is responsible for the interaction with Chs4p was identified by using yeast two hybrid system. Deletion of that domain of 50 amino acids, termed Maximum Interacting Region of Chs3p with Chs4p (MIRC3-4) abolished interaction with Chs4p and some mutations in MIRC3-4 region resulted in disappearance of chitin ring at the early G1 phase, whereas the mutations in MIRC3-4 did not affect chitin synthesis in the cell wall after cytokinesis. CHS4 expression at the transcriptional level and chitin distribution in chs4 mutant cells indicated that CHS4 is involved in the synthesis of chitin ring at the G1 phase and cell wall chitin at the cytokinesis, suggesting that Chs4p regulates CSIII activity with different modes at the G1 phase and cytokinesis. Absence of chitin ring could be caused either by delocalization of Chs3p to the bud-neck or by improper interaction with Chs4p. When Chs3p mutant cells were stained with Chs3p-specific antibody to discriminate between those two alternatives, Chs3p was found to be localized to the bud-neck in all MIRC3-4 mutants. MIRC3-4 domain is probably involved in direct interaction with Chs4p at the G1 phase. Thus Chs3p may be activated from zymogenic form in cooperation with Chs4p, Bni4p, and septin complex for synthesizing chitin ring at the bud neck. Chitin synthesis is also crucial for Candida morphogenesis. Therefore it is important to characterize chitin synthase inhibitors, which can be used as antifungal agents. Nikkomycin Z is a competitive inhibitor of chitin synthases in fungi. It has been reported that it inhibits chitin synthases (Chs) 1 and 3, but not 2 of Saccharomyces cerevisiae. In this study, it was found that 1) Nikkomycin Z inhibited all three Chs isozymes of Candida albicans (CaChs). 2) growth inhibition by nikkomycin Z was observed on Spider and corn meal agar plate, but not on Lee s plate. 3) Growth inhibition by nikkomycin Z accompanied by the absence of septum and cell wall chitin, which in turn brought about cell lysis. Nikkomycin Z did not lyse cells in Lee s media and lysis was partially prevented in the presence of sorbitol as an osmostabilizer in Spider medium. Therefore, nikkomycin Z prevented the formation of septum and cell wall chitin by inhibiting chitin synthase activities in a growth media-dependent manner. Key words: chitin synthase 3, chitin ring, cell wall chitin, ScCHS4, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, chitin synthase, septum formation, nikkomycin Z, media composition.
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