Chitinase를 생산하는 균주분리와 그 균주가 만드는 Chitinase의 정제 및 특성 연구

Abstract

이번 연구의 목적은 산업적으로 유용한 chitin 분해효소인 chitinase 를 생산하는 균주를 토양에서 분리하고, 이 균주가 chitinase 를 생산하는 최적의 배양조건을 결정, 이런 조건에서 얻은 chitinase 를 순수하게 정제하여 그 특성을 알아내는 것이었다. 국내의 토양에서 분리한 chitin 분해 균주들 중에서 chitin 분해 능력이 가장 뛰어난 한 균주를 선택하였고, 이 균주는 형태학적, 생리학적으로 Bacillus licheniformis 와 가장 유사한 Bacillus 속임이 밝혀졌다. 이 균주는 colloidal chitin 과 함께 yeast extract, bactotryptone 을 질소원으로 첨가한 pH 6 의 액체 배지에서 40 ℃, 3 일간 배양시 최대의 chitinase 를 생산하였으며, colloidal chitin 과 lactose 가 유도물질로 작용하며, 균체외로 분비되는 세포외 효소였다. 균의 배양액을 가지고 ammonium sulfate fractionation (30 ～ 60 %), dialysis, affinity absorption, sephadex G-100 column chromatography, phenyl-sepharose CL-4B column chromatography, FPLC 를 실시해서 chitinase 를 순수하게 정제할 수 있었고, SDS-PAGE 를 통해서 분자량이 대략 63 KDa 임이 추정되었다. Chitinase 1 mg 이 l 분간 N-acetyl-D-glucosamine 5.2 μmol 을 유리시킬 수 있었으며, 이는 Streptomyces, Aeromonas, Fungi 속에서 밝혀진 chtinase 보다는 활성이 높은 값이었다. ; The purpose of this research was to isolate a chitinase producing bacterium, optimize culture conditions for chitinase production and purify the enzyme. A bacterial strain producing chitinase highly was isolated from soil and determined to be Bacillus sp. based on its morphological and physiological characteristics. Optimal culture condition of Bacillus sp. for chitinase production was 72 hr incubation in the medium(pH 6.0) containing colloidal chitin 0.7 %, yeast extract 0.7 %, bactotryptone 0.7 % and other minerals at 40 ℃. And colloidal chitin and lactose were inducers for chitinase production and the chitinase was an extracellular enzyme. In these conditions, the enzyme protein was purified by several purification steps ; ammonium sulfate fractionation(30～60 %), 1 % colloidal chitin affinity adsorption, sephadex G-100 column chromatography, phenyl-sepharose CL-4B column chromatography, and FPLC. The specific enzyme activity was 5.78 unit/mg and the molecular weight of the purified enzyme was estimated to be about 63 KDa by SDS-PAGE. Chitinase was stable at weak alkaline pH and thermostable relatively.