Saccharomyces cerevisiae의 chitin synthase 3조절기작 규명과 Candida albicans에서 chitin synthases의 항진균제에 대한 저해도 조사

Abstract

Three chitin synthases(SCChs1, SCChs2, SCChs3) are detected in Saccharomyces cerevisiae. Despite significant homology in gene structure, they function at different time during the cell cycle and at different cellular locations : SCChs1 functions as repair enzyme of daughter cell to compensate the excessive digestion of chitinase after cytokinesis, SCChs2 is involved in the formation of septum, and SCChs3 is responsible for the chitin ring and chitin in the cell wall. These isozymes exist as zymogens which are regulated post-translationally at different locations. Therefore their regulation is important for cell growth. Of these, however, only SCChs3 is intensively investigated because its regulator, named SCChs4 and SCChs5, are identified. SCChs4 is known to interact with SCChs3. We narrowed interacting region and found no homology with other chitin synthase isozymes of S. cerevisiae, but high conservation in the same isozyme of 6 other fungi (Candida albicans, Neurospora crassa, Magnaporthe griseal, Ustilago maydis, Aspergillus nidulans). By sequence analysis, nine amino acids in this region were well conserved. Mutagenesis was performed and yeast two-hybrid system was used to identify the amino acid responsible for the interaction. When glutamic acid on 663 position was substituted by methionine, the interaction chitin synthase 3 activity seemed to be reduced based on reporter assay(β-galatosidase activity) and enzyme assay. Further mutagenesis is in progress to make double or triple mutants to reveal the regulatory mechanisms. Next, the antifungal activity of five compounds were analyzed by new screening system in C. albicans. Because the eucaryotic host cell does not posses cell wall, the chitin, major component of cell wall is a good target of antifungal agents Three kinds of chitin synthase activity are also found in C. albicans. The enzymatic characterization turns out that chitin synthase 1(CAChs1) and 2(CAChs2) in C. albicans are homologs of the SCChs2 and SCChs1 of S. cerevisiae, respectively. Chitin synthase 3(CAChs3) is a counter part of SCChs3 of S. cerevisiae. These three isozymes are, previously, characterization depending on different pH and divalent cation in this lab. The anitifungal activites of five antifungal agents are tested to the effect of chitin synthases by new screening system including polyoxin D, nikkomycin Z, catechin, prodigiosin, and gomicin N. The antifungal activities of polyoxin D and nikkomycin Z were previously reported to selectively inhibit chitin synthase isozymes in S. cerevisiae. For SCChs1, Nikkomycin Z is stronger inhibitor than polyoxin D and reverse is true for SCChs2. By new screening system in C. albicans, the sensitivities of C. albicans chitin synthase isozymes are different from those of S. cerevisiae chitin synthase isozymes. The striking difference is the sensitivity of CAChs1 to nikkomycin Z. CAChs1 is strongly inhibited by nikkomycin Z while SCChs2, a homolog of CAChs1, is barely affected. The inhibitory activities of catechin, prodigiosin and gomicin N showed different patterns from those of polyoxin D and nikkomycin Z. Catechin, prodigiosin and gomicin N are stronger inhibit CAChs1 than CAChs2 and CAchs3. Of two organisms(S. cerevisiae and C. albicans), the other compounds also show different sensitivities to chitin synthases. Because C. albicans is a pathogen whereas S. cerevisiae is not, the former is in principle a better organism for screening of antifungal agents. These informations could be helpful for the treatment of the immunocompromised patients by selecting the appropriate antifungal agents. ; 효모(Saccharomyces cerevisiae)에서는 세 개의 chitin synthase 활성도가 있는 동위효소들, chitin synthase 1, 2, 3 (이 후 SCChs1, SCChs2, SCChs3이라 명함)가 있다. 이들은 유전자 구조면에서 높은 homology를 보임에도 불구하고 세포분열이 일어나는 동안, 다른 시기에 작용을 하고, 또 세포내의 다른 위치에서 기능을 한다. SCChs1은 세포분열 후 딸 세포의 birth scar부위에서 소실된 chitin을 보충하는 repair 기능을 담당하고, SCChs2는 septum 형성에 관여 하며, SCChs3는 chitin ring 형성과 세포벽에 존재하는 chitin의 대부분을 합성하는 기능을 가지고 있다. 이들 동위효소들은 zymogen으로 존재하고 다른 위치에서 번역이후(post-transctipion) 조절을 받는다. 이들이 세포성장에 중요하게 작용을 하고 있음에도 불구하고, 조절기작에 대해서는 거의 알려지지 않은 상태이다. 단지 SCChs3의 조절자인 SCChs4와 SCChs5만이 분리되었을 뿐이고, SCChs4는 SCChs3와 상호작용을 한다고 알려져있다. 본 연구에서는 SCChs3와 SCChs4의 상호작용을 two-hybrid test를 통하여 다시 한번 확인하였고, SCChs3를 여러부분으로 나누어 SCChs4와 직접적으로 상호작용하는 부분을 약 150 base pair로 한정할 수가 있었다. 이 부분은 S. cerevisiae의 다른 chitin synthase 동위효소들(SCChs1, SCChs2)과는 전혀 homology를 갖지 않지만, 다른 6종의 fungi(Candida albicans, Neurospora crassa, Magnaporthe friseal, Ustilago maydis, Aspergillus nidulans)의 같은 동위효소들에서는 매우 homology가 높은 것으로 나타났다. 골라낸 이부분에서 특히 9개의 amino acid가 homology가 높은 것으로 나타나는데, 이들의 상호작용에 중요한 amino acid를 알아보기 위해 mutagenic analysis를 수행하였다. 그 결과 663번째 위치의 amino acid인 glutamic acid가 methionine으로 치환되었을 때 상호작용이 감소하는 것을 β-galactosidase assay를 통해 관찰하였다. Amino acid가 치환된 유전자를 가진 strain에서 chitin synthase 3의 enzymatic activity를 봄으로써 이 부분이 상호작용에 중요한 부분임을 확인하였다. 이들 유전자의 상호작용에 대해, 여러 실험 결과를 통하여 SCChs3와 SCChs4와의 조절에 미치는 영향을 조사할 수 있었다. 이러한 조절 기작의 규명이 S. cerevisiae에서 cell wall의 형성을 밝히는데 도움이 될 것이다. 또한 병원성 곰팡이(예, Candida albicans)에서는 숙주인 동물세포에는 없는 chitin을 선택적으로 조절하므로, 이들 유전자의 조절 기작은 병원성 곰팡이에 의한 감염을 치료할 수 있는 치료제의 개발에 도움이 될 것이다. 병원성 곰팡이에 의한 감염 치료에 도움을 줄 수 있는 또 다른 screening system으로, 항진균 성분에 대한 chitin synthase 동위효소들의 저해정도를 조사하였다. 항진균 성분 중 polyoxin D와 nikkomycin Z의 항진균 활성도는 Saccharomyces cerevisiae에서 chitin synthase 동위효소들을 선택적으로 저해한다는 것이 이미 알려져 있다. 그리고 병원성 곰팡이인 Candida albicans에서 새로운 screening system에 의하면 C. albicans의 chitin synthase 동위효소들인 chitin synthase 1, 2, 3 (이후 CAChs1, CAChs2, CAChs3 라 명함) 또한 S. cerevisiae와 저해받는 것이 약간의 차이가 있는 것으로 나타났다. Polyoxin D와 nikkomycin Z는 CAChs2를 가장 강하게 저해하고, catechin, gomicin N, prodigiosin은 CAChs1을 보다 더 저해하는 것으로 나타나 항진균 성분들에 따라 동위효소들이 다르게 저해받고 있음을 알 수가 있었다. 두 yeast에서 서로 다른 항진균 성분들은 또한 chitin synthase에 다른 의미를 갖는데, C. albicans는 pathogen인 반면 S. cerevisiae는 그렇지 않기 때문이다. 이러한 것들은 적절한 항진균제의 개발에 도움을 주어 병원성 곰팡이가 원인이 되어 병이 발생하는 면역 저하증 환자등의 치료에 도움이 될 것이다.