SDS와 NaOH를 이용한 Polyhydroxyalkanoates의 분리정제에 관한 연구

Abstract

현재 상품화되어 있는 대부분의 플라스틱은 사용 후 자연환경에 버려질 때 분해되지 않으므로 환경문제를 야기시키고 있다. 따라서 생분해성 플라스틱에 대한 사회적인 요구가 높아지고 있다. PHA는 이러한 생분해성 플라스틱의 하나로서, 기존의 합성 플라스틱과 물성이 유사하면서 사용 후 완전히 분해되기 때문에 관심을 모으고 있다. 그러나 비싼 생산단가로 인하여 상용화에 걸림돌이 되고 있다. 본 연구에서는 A. latus의 phbC gene을 cloning한 A. eutrophus GA5를 이용하여 인산염 제한하에서의 유가식 배양을 통해 HV의 함량을 높이고자 하였으며, 발효에 의해 생산된 PHA를 효과적으로 분리·정제해 내기 위한 방법에 관하여 연구하였다. 주요 연구결과는 다음과 같다. GA5 균주를 이용하여 다양한 인산염농도와 P/G(propionic acid/glucose)의 몰비에 따른 유가식 배양을 수행하였다. 인산염 제한으로 인해 배양기간동안 poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) 합성이 유도되는데, 초기 인산염의 농도와 P/G 몰비가 PHB/V, 특히 3-hydroxyvalerate의 생산에 미치는 영향에 대해 조사하였다. 연구결과, 배양액내의 초기 인산염의 농도가 2g/L와 4g/L일 때 건조세포중량, PHB/V 함량 그리고 HV의 함량은 각각 120과 128g/L, 61와 65% 그리고 4.94와 5.85mol%였다. 그리고 초기 인산염의 농도가 2g/L일 때 P/G의 몰비가 0.1에서 0.2로 증가하면, 건조세포중량과 PHB/V의 함량은 각각 120g/L에서 99.3g/L로, 61%에서 57%로 감소하였다. 그러나, HV의 함량은 4.94mol%에서 7.07mol%로 증가하였다. 또한, Alcaligenes eutrophus의 세포배양액내의 PHA를 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 이용하여 정제하였다. 세포배양액내의 PHB 함량이 75%일 때, 세포농도가 200g/L이하이고 SDS/Biomass의 중량비가 0.3이상에서 95%이상의 순도와 회수율을 얻을 수 있었다. 특히, 250～300g/L의 고농도 세포배양액에서도 같은 조건하에서 94%이상의 순도와 99%이상의 회수율로 정제할 수 있었다. 따라서 SDS를 이용한 정제법이 현재 생산가능 수준인 280g/L의 고농도 세포배양액도 손쉽게 정제할 수 있는 효율적인 방법임을 알 수 있었다. 용해된 순수세포물질의 양은 SDS의 투여량과 함께 증가하였으며, 다양한 PHA 함량을 가진 세포배양액에서 SDS 1g은 약 0.71g의 순수세포물질을 용해시킬 수 있었다. PHA 함량이 낮은 세포배양액을 고순도로 정제하기 위해, SDS와 NaOH를 함께 사용하여 정제하였다. 연구결과, SDS만으로 처리하였을 때에 65%였던 순도를 94%까지 올릴 수 있었다. 또한 SDS와 NaOH를 이용한 정제공정은 NaOH/Biomass의 중량비가 0.02이하이고 SDS/Biomass의 중량비가 0.3이하에서 회수된 PHA의 분자량을 감소시키지 않았으며, 위 조건에서 5.0×10^5～ 5.7×10^5의 중량평균분자량값을 나타내었다. ; Plastic materials have become an integral part of contemporary life, but these nondegradable plastics accumulate in the environment. Among the candidates for biodegradable plastics, Polyhydroxyalkanoates(PHA) have been drawing much attention because of their similar material properties to conventional plastics and complete biodegradability. However, PHA are currently too expensive to be used as bulk plastic material. In this study, PHA production was investigated using Alcaligenes eutrophus GA5. A new PHA recovery method using SDS and NaOH was developed. Fed-batch cultures were carried out at various phosphate concentrations and P/G(mol of propionic acid/mol of glucose) ratio using Alcaligenes eutrophus GA5 cloning with phbC gene of Alcaligenes latus. During the fermentation, poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) accumulation was induced by phosphate limitation. It was investigated the effect of initial phosphate concentration and P/G ratio on the PHB/V production especially 3-hydroxyvalerate. The final dry cell weight of 120 and 128g/L, PHB/V content of 61 and 65% of dry cell weight and HV content of 4.94 and 5.85 mol% were obtained when the initial phosphate concentrations in the medium were 2 and 4g/L, respectively. With increasing P/G ratio from 0.1 to 0.2 at 2g/L of initial phosphate concentration, dry cell weight and PHB/V content were decreased from 120g/L to 99.3g/L and from 61% to 57%. However, HV content was increased from 4.94 mol% to 7.07 mol%. This is the high value under low P/G ratio below 0.2. PHA recovery using SDS(sodium dodecyl sulfate) was carried out with the cell broth of Alcaligenes eutrophus. When PHB content of the cell broth was 75%, the cell concentrations were below 200g/L and the weight ratio of SDS to biomass was over 0.3, the purity and recovery of PHB were obtained over 95%. Especially, in the case of high density cell broths(250～300g/L cell concentrations), the purity and recovery were over 94% and 99% at the same conditions. Therefore, SDS digestion method was effective to recovery of high density cell broths. Digested NPCM(non-PHB cell material) was increased linearly with SDS dosage, and SDS of 1g can digest NPCM of approximately 0.71g at various PHA contents. For recovery of the cell broth containing low PHA content, PHA recovery using SDS and NaOH were carried out. When NaOH was added with SDS for recovery of PHA, the purity was increased from 65% to 94% compared with only SDS treatment. Futhermore, when the weight ratio of NaOH and SDS to biomass were below 0.02 and 0.3 respectively, the average molecular weight were not reduced by NaOH and SDS. In this condition, molecular weight were 5.0×10^5～5.7×10^5.