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in vitro상에서 datp와 cytochrome c에 의존하는 세포사멸에 관련된 단백질 및 금속이온이 유도하는 dna절편화와 핵막분해 현상의 관계에 관한 연구

Title
in vitro상에서 datp와 cytochrome c에 의존하는 세포사멸에 관련된 단백질 및 금속이온이 유도하는 dna절편화와 핵막분해 현상의 관계에 관한 연구
Authors
김보은
Issue Date
2000
Department/Major
대학원 분자생명과학부
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Abstract
1. DNA 절편화와 핵막 분해에 K^+ 이온이 미치는 영향. 세포사멸이 진행되는 세포에서는 genomic DNA의 절편화와 핵막 분해, 크로마틴 응집, 세포 응축 등 특징적 지표를 관찰할 수 있다. 이 중 세포의 부피 감소 현상은 K^+ efflux가 주요 원인으로 생각된다. 본 연구에서는 지금까지 알려진 세포사멸 신호 전달 경로들에 대해 K^+ 이온이 저해 작용을 하는지를 관찰하고, K^+ 이온이 저해작용을 일으키는 단계를 조사하였다. 분리된 핵에 KCl을 농도별로 처리하고 dATP와 cytochrome c로 in vitro 세포사멸을 유도하여 DNA 절편화와 핵막 분해 현상을 관찰한 결과, K^+ 농도가 세포내 존재 농도인 150 mM에 근접하면 이와 같은 세포사멸 현상이 저해되는 것을 확인하였다. 또 이 경우에 DEVDase의 활성화와 caspase-9, caspase-3, DFF40의 processing이 DNA 절편화와 유사한 경향으로 저해되는 것을 알 수 있었다. Caspase-9의 processing 저해로 인해 그 하위 경로의 processing을 확인할 수 없었으므로, 이 경로들에 대한 K^+ 이온의 저해작용을 확인하기 위해 caspase-3에 의한 in vitro 세포사멸을 유도하여 DNA 절편화와 핵막 분해 현상을 관찰한 결과, K^+ 이온이 그 하위 경로에 대해서도 억제 효과를 나타낸 것을 확인하였다. 그러나 이 경우, caspase-3의 DFF45 processing을 저해하지는 못하였으며, 따라서 K^+ 의 저해작용은 DFF40의 활성에 관여하는 것으로 보인다. 또 20 mM KCl에서 dATP와 cytochrome c를 처리하여 pre-incubation 을 통해 caspase-9에 의한 세포사멸 신호 전달 경로를 DFF40까지 활성화시킨 후, 다시 KCl을 농도별로 처리하였을 경우에도 DNA 절면화와 부분적 핵막분해 현상에 대해 K^+ 이온이 저해작용을 나타내는 것을 확인하였다. 이 결과를 볼 때 K^+의 저해작용은 세포사멸 선호 전달경로에서 caspase-9 processing을 저해하여 그 하위 경로를 억제하는 것으로 생각되며, 또한 DFF40의 활성에도 저해작용을 나타내어 세포사멸의 진행을 저해하는 것으로 생각된다. 따라서 K^+의 저해 작용은 세포사멸 신호전달 경로의 어느 한 단계에만 개입되는 것이 아니라 caspase-9의 processing, DFF40의 DNA 절편화 과정 등 상위와 하위의 여러 단계에 걸쳐 저해작용을 나타내는 것으로 생각된다. 2. 금속이온에 의해 유도되는 세포사멸의 protease inhibitor의 저해작용 세포사멸이 진행되는 세포의 핵에서는 DNA 절편화와 핵막 분해와 같은 현상을 관찰할 수 있는데, in vitro상에서 특정 금속이온들이 세포사멸시 핵에서 나타나는 특징적인 현상들, 즉, DNA 절편화와 핵막 분해를 유도할 수 있다는 사실은 잘 알려져 있다. 여기에서는 Ca^2+, Mn^2+, Co^2+ 세 금속이온이 유도하는 DNA 절편화와 핵막분해 현상에 대한 TPCK, Zn²+, ATA, APF의 저해작용을 조사하여 이들의 경로와 이들이 유도하는 DNA 절편화 현상과 핵막분해 현상과의 관계를 알아보았다. Ca^2+ 이온은 세포질을 통한 경로보다는 직접 핵에 작용하여 핵 안의 serine protease와 DNase를 활성화하여 DNA 절편화를 일으키는 것으로 보인다. Ca^2+ 이온의 세포질을 경유하는 DNA 절편화는 세포질이 없는 조건의 경우와 비교할 때 특이적으로 증가하지는 않았으며, TPCK, APF, ATA, Zn^2+에 의해 저해되었다. Ca^2+ 이온이 유도하는 핵막분해 현상에 대해서도 같은 저해제가 유사한 경향을 보였으며, 따라서 DNA 절편화와 유사한 경로를 거치는 것으로 보인다. Mn^2+ 이온은 세포질이 존재하는 경우 더 강한 DNA 절편화 현상을 일으키는 것으로 알려졌다. 이 경우, TPCK, APF, ATA, Zn^2+에 의해 저해작용이 나타나며 따라서 Mn^2+ 이온은 세포질 내의 endonuclease나 protease를 활성화시키는 경로에 크게 의존하는 것으로 보인다. Mn^2+ 이온이 나타내는 핵막 분해 현상에서도 같은 저해제에 의한 억제 효과가 나타나며 DNA 절편화와 핵막 분해 현상에의 저해패턴이 Ca^2+ 이온의 경우와 마찬가지로 유사한 것을 알 수 있다. Co^2+ 이온은 세포질이 존재하는 경우에만 DNA 절편화 현상이 유도되며, 세포질이 존재하는 경우라도 핵막 분해 현상은 유도되지 않는다. DNA 절편화 현상은 Mn^2+ 이온의 경우와 유사하게 TPCK, APF, ATA, Zn^2+이 저해작용을 보였으며, 이 또한 세포질내의 endonuclease나 protease가 관여할 것으로 보인다. 이에 세포질을 분획하여 각각의 금속이온을 처리하자 크게 두 개의 활성분획이 나타났는데, 각 금속이온은 이 두 DNase를 활성화시키는 강도가 서로 다른 것으로 나타났다. 따라서 세 이온의 세포질 경로는 활성화시키는 DNase와 그 활성화 정도에서 차이가 존재한다는 것을 알 수 있다. 이와 같은 결과를 볼 때, Ca^2+, Mn^2+ 이온이 세포질없이 DNA 절편화 현상을 나타내는 경로는 핵내의 serine protease를 경유하는 것으로 생각되나, 이에 관한 연구는 진행되지 않았다. 또한 세포질이 있는 경우의 DNA 절편화 현상은 serine protease와 endonuclease가 작용하는 것으로 보여진다. 특히 endonuclease는 세 금속이온이 각각 세포질 내의 두 종류의 DNase를 서로 다른 정도로 활성화하여 나타나는 것으로 보이며, 이들 금속이온이 유도하는 DNA 절편화 현상과 핵막 분해 현상은 각각의 저해 패턴과 IC_50 수치를 비교해 볼 때 서로 밀접한 연관관계가 있을 것으로 생각된다. 또한 TPCK와 같은 protease 저해제가 각 금속이온에 의한 DNA 절편화를 저해하는 현상은 L-DNase II의 경우와 같이 금이온에 의해 활성화되는 protease가 다시 세포질내의 DNase를 활성화시키는 경로를 거치는 것으로 생각할 수 있다. ; 1. Inhibitory effect of K^+ ion on DNA fragmentation and nuclear fragmentation. Cells undergoing apoptosis reveal the characteristic morphological features such as genomic DNA fragmentation, nuclear fragmentation, chromatin condensation, and cell shrinkage. The intracellular K^+ concentration was reported to play important roles in the process, but biochemical studies have not been well investigated. In this study, the death signal pathway influenced by K^+ was determined and biochemically characterized using in vitro apoptosis induced by dATP and cytochrome c. DNA fragmentation and nuclear fragmentation were observed in the presence of up to 50 mM KCl. However, both of the processes were severly inhibited in the presence of increasing concentrations of KCl and were completely blocked at 150 mM KCl, the physiological K^+ concentration in the inside of cell. Along with these, the activation of caspase-9, caspase-3, and DFF45 were all inhibited. Since the event downstream of caspase-9 couldn t be examined, purified caspase-3 instead of dATP cytochrome c as in vitro apoptosis inducer was used to induce in vitro apoptosis. Although the DNA fragmentation and nuclear fragmentation were similarly inhibited in the presence of the high concentration of KCl, the processing of DFF45 appeared not to be affected, suggesting that K^+ ion seems directly to have an effects on the activity of DFF40. To clarify the effect, the cell extract were preincubated in the presence of dATP, cytochrome c and 20 mM KCl to activate DFF40 and the effect of K^+ ion on the DNA fragmentation and nuclear fragmentation were examined. DNA fragmentation and nuclear fragmentation which partially occurred in the condition were severely inhibited in the presence of more than 75 mM KCl. These results show that K^+ at the normal physiological concentration suppresses the apoptosis by inhibition of the activation of caspas-9 and the downstream cascade, and the effect seems to be augmented by the inhibition of activity of DFF40. In conclusion, K^+ has the inhibitory effects on the multiple steps of apoptosis signalling pathway to accomplish the complete inhibition of apoptosis under the normal physiological condition. 2. Inhibitory effect of protease inhibitors on metal ion-induced apoptosis. Well characterized features of apoptosis include DNA fragmentation and nuclear fragmentation. It is known that some metal ions were known to induce the apoptotic-like changes. In this work, inhibitory effects of several inhibitors, TPCK, ATA, APF, Zn^2+, on metal ion-induced DNA fragmentation and nuclear fragmentation and also the relationship between DNA fragmentation and nuclear fragmentation were investigated. Ca^2+ operated directly on nuclei and induced DNA fragmentation. TPCK, ATA, APF, Zn^2+ revealed inhibitory effect on the DNA fragmentation, suggesting that serine protease and DNase exist in this pathway. Ca^2+-induced nuclear fragmentation were inhibited by the same inhibitors in the similar pattern, and seems to pass through the same pathway. Mn^2+ induced the stronger DNA fragmentation and nuclear fragmentation in the presence of cell extract, compared with that in the absence of cell extract and TPCK, ATA, APF, Zn^2+ showed inhibitory effects both on DNA fragmentation and on nuclear fragmentation. Therefore, Mn^2+ seems also to activate serine protease and DNase, and DNA fragmentation and nuclear fragmentation seems to pass through the same pathway. On the other hand, CO^2+-induced DNA fragmentation revealed only in the presence of cell extract, and nuclear fragmentation did not show even in the presence of the cell extract. The DNA fragmentation was inhibited by TPCK, ATA, APF, Zn^2+, and also thought to activate endonuclease or proteases. We fractionated the cell extract by using DEAF-column, and detected two peaks activated by metal ions. The three metal ions have different effects on the activation of those DNase fractions in the degree and kind that may explain the differential DNA fragmentation observed in this study. These results demonstrate that metal ions could induce DNA fragmentation by activating the DNases with different effects, and the DNA fragmentation and nuclear fragmentation are closely related. Also, the inhibitory effect of protease inhibitor, TPCK on the DNA fragmentation and nuclear fragmentation suggests that the metal ion-induced DNA fragmentation and also nuclear fragementation occur through the pathway requiring a serine protease, as shown in the activation of L-DNase II.
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