MCF-7 사람 유방암 세포에서 CYP1A1 유전자 발현 억제 인자 탐색

Abstract

Cytochrome P4501AI (CYP1A1) is known to be inducible by xenobiotic compounds such as polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) and dioxins such as 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin (TCDD). And these induction of CYP1A1 is also regulated by many categories of chemicals. In order to investigate the effects of several chemicals on CYPIAI gene expression in MCF-7 cells, 5 flanking DNA of human CYPIA1 was cloned into pGL3 basic vector containing luciferase gene, and then trasnfected into MCF-7 cells. After treatment of chemicals, the luciferase activity was measured. When TCDD was treated, the luciferase activity was induced in dose and time dependent manner. 17β-Estradiol significantly inhibited TCDD stimulated luciferase activity dose dependently and this inhibition was partially recovered by concomitant treatment of tamoxifen. 17β-Estradiol metabolites, 2-hydroxyestradiol and 16 a -estriol resulted in less potent inhibitory effect than estradiol and synthetic estrogen, diethylstilbestrol (DES) showed no effect on CYP1A1 gene expression. Some flavonoids such as genistein, morin, naringenin, chrysin, kaempferol, daidzein and resveratrol and alkylphenol compounds, octylphenol and nonylphenol were also investigated. Genistein, morin and naringenin exhibited stimulatory effect at low concentration and inhibitory effect at high concentration. Chrysin, kaempferol, daidzein, octylphenol and nonylphenol exhibited inhibitory effect at only high concentration. Resveratrol decreased TCDD induced luciferase activity dose dependently. To study the effects of hypoxic condition on the TCDD induced CYP1A1 gene expression, cobalt chloride, picolinic acid and deferoxamine were administrated before the treatment of TCDD. All these reagent decreased the luciferase activity induced by TCDD. NF-κB inhibitor, pyrrolidine dithiocatbamate (PDTC) showed no effect on CYPIA1 gene expression. The benzimidazole compound omeprazole induced the luciferase activity dose dependently. Like TCDD, omeprazole induced luciferase activity was decreased by 17β-estradiol and its metabolites, 2-hydroxyestradiol and 16 α-estriol, and not affected by DES. The effect of genistein on the luciferase activity induced by omeprazole was similar to that of TCDD. An antagonist of Ah receptor, α-naphthoflavone did not inhibit the induction of CYP1A1 produced by omeprazole but did inhibit that produced by TCDD. These data shows that omeprazole appears to induce CYPIA1 by different mechanisms from TCDD. ; Cytochrome P4501A1은 주로 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD)와 같은 다환상 방향족 탄화수소에 의해 유도되는데 이러한 유도 작용은 여러 가지 화합물에 의해 조절을 받는다. 본 실험에서는 MCF-7 사람 유방암 세포에서 여러 화학 물질이 CYP1A1 유전자 발현에 미치는 영향을 알아보고자 사람의 CYP1A1 의 5 flanking DNA를 luciferase reporter 유전자를 포함한vector에 clone하여 (phCYP1A1-luc) MCF-7 세포에 transfection 한 뒤, 여러가지 화합물을 처리하여 발현되는 luciferase 활성을 측정하였다. Estrogen receptor (ER)가 존재하는 MCF-7 세포에서 17 β-estradiol은 TCDD에 의해 유도 발현된 luciferase 활성을 감소시켰으며, 이러한 감소 효과는 ER의 부분 길항제인 tamoxifen과의 병용 처치로 부분적으로 회복되었다. 그러나 합성 estrogen인 diethylstilbestrol은 TCDD에 의해 증가된 luciferase활성에 영향을 미치지 않았다. 17β-Estradiol 대사체인 2-hydroxyestradiol과 16α-estriol은 모두 TCDD에 의한 luciferase 활성 증가를 억제하였는데, 그 억제 효과는 17β-estradiol보다 낮은 것으로 나타났다. 여러 가지 flavonoid들을 TCDD와 병용 투여하였을 때, 고농도에서는 모두 TCDD에 의해 증가된 luciferase 활성을 감소시켰으나, genistein, morin,naringenin의 경우는 저농도에서 TCDD에 의한 luciferase 활성 증가를 증폭시켰다. Chrysin과 naringenin은 단독 처치하였을 때 luciferase 활성의 증가를 보였다. 저산소 상태 유도 물질인 cobalt chloride (CoCl_2), deferoxamine (Dfx), picolinic acid (PA)는 TCDD에 의한 luciferase 활성 증가를 억제하였는데, 그억제 효과는 Dfx > CoCl_2 > PA 의 순으로 나타났다. NF-_K B 저해제인 pyrrolidine dithiocarbamate는 단독 혹은 TCDD와 병용 투여한 경우 모두 luciferase 활성에 영향을 미치지 않았다. Omeprazole은 MCF-7 세포에서 luciferase 활성을 증가시켰으며, 그 정도는 낮으나 TCDD에서와 유사한 경향으로 17β-estradiol 및 그 대사체에 의해 luciferase 활성이 감소되었으며, diethylstilbestrol에 의한 효과는 관찰되지 않았다. Genistein과 병용 처치하였을 때, 저농도에서는 omeprazole에 의한 luciferase 활성 증가를 증폭시켰으며, 고농도에서는 억제 효과를 나타내었다. 그러나 aryl hydrocarbon receptor (AhR)의 부분 길항제인 α-naphthoflavone(α-NF)은 TCDD에 의한 luciferase 활성은 감소시켰으나 omeprazole에 의해 증가된 luciferase 활성에는 영향을 주지 않았으며, 17β-estradiol에 의한 luciferase 활성 억제 효과가 α-NF과의 병용 처치로 감소하는 것으로 보아, omeprazole은 AhR 매개가 아닌 다른 기전을 통해 CYP1A1 유전자 발현을 증가시키는 것으로 생각된다.