사람 혈액종양세포에서 Fas 및 trail에 의해 유도되는 세포고사에 관한 연구

Abstract

항암제에 내성을 보이는 종양세포는 그 세포 표면에 Fas수용체 발현의 결함과 Fas/FasL 상호 작용에 의한 세포고사에 장애를 보이며, 혈액 종양을 포함한 여러 종양세포가 가지는 항암제에 대한 다제약제 내성(multiple drug resistance)에 Fas수용체 및 TRAIL(TNF-related apoptosis induced ligand) 수용체의 발현과 이것으로 매개되는 세포고사(apoptosis)가 중요한 부분을 차지한다. 본 실험에서는 사람 혈액 종양세포에서 Fas 배위자(ligand) 및 TRAIL로 매개되는 세포고사에 관여하는 유전자들의 발현 여부를 알아보고 주동적 Fas 항체(agonistic Fas antibody)나 재조합형(recombinant) 수용성(soluble) TRAIL을 이용하여 세포고사를 유도해 본 후 cycloheximide을 사용하여 세포고사 정도의 변화를 살펴보고자 하였다. 실험 세포로 사람의 혈액 종양 세포인 HL-60, KG-1, THP-1, K562, U937, Jurkat, IM-9 등 7개 세포를 대상으로 실험하였고, 유전자의 발현은 RT-PCR과 Western blot으로 구하였다. Fas수용체에 대한 주동적 항체와 재조합형(recombinant) 수용성 TRAIL을 사용하여 시간과 농도 변화에 따른 세포고사를 살펴보고, 이들 세포를 cycloheximide로 전 처리한 후 다시 주동적 Fas 항체 및 재조합형 TRAIL로 처리하여 각 세포의 세포고사 정도의 변화를 관찰하였다. Fas에 의해 매개되는 세포고사의 경우, 7개 세포 중 K562 세포에서만 Fas수용체의 발현을 보이지 않았고, THP-1과 U937 세포에서는 약하게 그리고 나머지 4개 세포에서는 양성을 보였다. 7개 세포 중 주동적 Fas 항체에 의한 세포고사에 Jurkat, IM-9과 KG-1 세포만 반응을 보였고 나머지 세포에서는 저항성을 보였다. 이러한 세포고사의 반응은 FAP-1의 발현정도와는 무관하였다. Cycloheximide로 전처리 시 세포고사에 저항을 보였던 세포들 중 Fas수용체의 발현이 없거나 약했던 K562, THP-1, U937 세포는 계속 세포고사에 저항을 보였으나, Fas수용체가 많이 발현되는 HL-60 세포는 세포고사에 대해 감수성을 나타내게 변화되었고, 감수성을 보였던 Jurkat, KG-1, IM-9 세포에서는 그 정도가 심화되는 것을 볼 수 있었다. TRAIL에 의해 매개되는 세포고사의 경우, 7개의 세포는 모두 DR4와 DR5 중 적어도 어느 하나 혹은 2개 모두를 발현하고 있었다. 7개 세포 중 TRAIL에 대한 세포고사에 대해 Jurkat 세포는 매우 강하게 반응하였고, HL-60, THP-1, K562 및 U937 세포에서는 고농도에서 장시간 처리 시 반응하였으며, KG-1과 IM-9 세포에서는 저항을 보였다. 이런 세포고사의 반응은 DcR1과 DcR2의 발현 정도와는 무관하였다. Cycloheximide로 전처리 시 모든 세포에서 TRAIL에 의한 세포고사에 감수성이 증가하였다. 이같은 결과로 혈액 종양 세포 중 Fas나 TRAIL로 매개되는 세포고사에 저항을 보이는 세포들 내에도 세포고사 과정에 사용되는 장치(machinery)는 이미 갖추어져 있음을 알 수 있었으며, 이러한 세포들에서 나타나는 저항성은 Fas나 TRAIL에 의한 세포고사를 억제하는 특정한 조절 단백질이 그 세포에 존재하기 때문으로 생각된다. 따라서 혈액 종양세포에서 이러한 Fas 또는 TRAIL에 의한 세포고사 장치는 종양의 치료 계획에 있어 목표가 될 수 있으리라고 기대된다. ; The Fas and TRAIL systems, comprising the Fas receptor (Fas/CD95/APO-1) and its ligand, Fas ligand (FasL), or TRAIL receptors (DR4, DR5, DcR1 and DcR2) and their ligand, TRAIL, are central mediators of programmed cell death or apoptosis in a variety of hematopoietic system. Fas-mediated apoptosis: Of seven malignant hematopoietic cell lines examined (HL-60, KG-1, THP-1, K562, U937, Jurkat, IM-9), all, except K562, were found to be positive for Fas receptor. However, despite Fas expression, The agonistic anti-Fas monoclonal antibody (7c11) induced apoptosis in only three of six Fas-expressing cell lines investigated, Jurkat, IM-9 and KG. RT-PCR analysis indicated that two Fas-resistant cell lines, THP-1 and U937, expressed very low levels of transmembrane and death domains of Fas, but the other Fas-resistant cell line, HL-60, expressed high level. This Fas-resistance did not correlated with high levels of mRNA for FAP-1, a Fas-associated phosphatase that can block the apoptotic function of Fas. TRAIL-mediated apoptosis: Of seven malignant hematopoietic cell lines examined, all were found to be positive for either one or both DR4 and DR5 TRAIL receptors. However, despite expression of DR 4 or DR5 cells showed different sensitivity to TRAIL-induced apoptosis. Jurkat cells were highly sensitive ; HL-60, THP-1, K562 and U937 cells were moderately sensitive ; and KG-1 and IM-9 cells were resistant to TRAIL-induced apoptosis. This TRAIL-resistance did not correlated with high level of mRNA for DcR1 and DcR2, decoy receptor for TRAIL which have no or truncated intracellular death domain. Treatment with cycloheximide converted the phenotype of some resistant cell lines from Fas-resistant to Fas-sensitive, and TRAIL-resistance to TRAIL-sensitive; and increased the sensitivity to agonistic anti-Fas in Fas-sensitive, and to TRAIL in TRAIL-sensitive cell lines. These results suggest that the apoptotic machinery is already in place in Fas-resistant and TRAIL-resistant cell lines. Elucidating the steps in such an active process of resistant to apoptosis might be expected to provide new approaches for therapeutic intervention of hematopoietic malignancies.