Ethoxyresorufin-O-dealkylase 활성 측정을 통한 CYP1A1유전자 발현 조절 연구

Abstract

CYP1A1은 생체 내에서 기질에 monooxygenation 시키는 역할을 하는 대사 효소로 높은 기질 특이성을 지니며, 물질의 무독화뿐만 아니라 독성 대사 중간체를 생성하는 작용도 지니고 있다. CYP1A1는 주로 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxine (TCDD)나 3-methylcholanthrene (3-MC) 같은 다환상 방향족 탄화수소에 의해 유도되는데, 여러 가지 화학 물질들이 이 CYP1A1의 발현에 영향을 미친다. 본 실험에서는 Hepa-1 세포와 MCF-7 세포에서 여러 가지 물질에 의해 내인성 CYP1A1의 발현이 조절되는 것을 ethoxyresorujfin-ο-dealkylase (EROD) 활성 측정법을 이용하여 관찰하였다. Hepa-1 세포에 여러 가지 flavonoid들은 TCDD와 병용 투여 시 methoxsalen > chrysin > myricetin > morin > quercetin 순으로 TCDD에 의한 EROD 활성 증가 효과를 억제하였으며, genistein은 TCDD에 의한 EROD 활성 증가를 증폭시켰다. MCF-7 세포에 여러 flavonoid들은 단독 투여 시 myricetin ≫ chrysin > quercetin ≒ methoxsalene 순으로 EROD basal level을 감소시켰다. Hepa-1 세포에 glucocorticoid, insulin, DDB, DDBS를 TCDD와 병용 투여 시, TDCC 단독 투여 경우의 EROD 활성을 100%로 봤을 때, 각각 77%, 26.8%, 66%, 47.5%로 TCDD에 의한 EROD 활성 증가를 억제 하였으며, retinoic acid를 TCDD 와 병용 투여 시에는 10^-9M에서만 37% 정도의 TCDD에 의한 EROD 활성 증가를 억제하였다. MCF-7 세포에 retinoic acid, glucocorticoid, omeprazole을 단독 투여시 대조군의 EROD 활성을 100%로 봤을 때, retinoic acid와 omeprazole만 각각 33.3%, 80%로 basal level EROD 활성을 감소시켰으나, glucocorticoid는 영향을 미치지 않았다. Hepa-1 세포에 estrogen을 TCDD와 병용 투여 시 TCDD에 의한 EROD 활성 증가를 억제하였고, MCF-7 세포에 ESTROGEN 단독 투여 시 EROD basal level을 감소 시켰다. 그러나. estrogen의 작용은 antiestrogen인 tamoxifen의 병용 투여에 의해서도 영향을 받지 않았고, estrogen의 대사체의 TCDD 병용 투여, 혹은 단독 투여 시 estrogen과 비슷한 효과가 나타나는 것으로 보아, 그 대사체를 매개로 한 작용으로 사료된다. Hepa-1 세포에서 일산화질소를 공급하는 물질인 sodium nitroprusside(SNP)와 inducible nitric oxide synthase(iNOS) 유도제인 lipopolysaccharide(LPS), iNOS 저해제인 N^G-nitro-l-arginine을 이용한 실험을 통해, 일산화질소가 TCDD에의한 EROD 활성 증가를 억제하는 경향을 나타냄을 관찰하였다. 또한, 저산소 상황을 유도하는 물질인 CoCl₂, desferrioxamine(DFX), picolinic acid(PA)를 TCDD와 병용 투여 시, TCDD에 의한 EROD 활성 증가를 억제하는 경향을 관찰하였고, 이러한 경향은 FeSO₄의 첨가로 복구될 수 있음을 관찰하였다. 저산소 상황과 일산화질소 신호 체계의 상호 교신 여부를 알아보기 위하여 저산소 상황을 유도하는 물질인 CoCl₂, desferrioxamine(DFX), picolinic acid(PA)와 iNOS 저해제인 N^G-nitro-l-arginine을 이용한 실험을 통해, 저산소 상황에서 일산화질소 생성을 통해 TCDD에 의한 EROD 활성증가를 억제함을 관찰하였다. 이상의 결과로 저산소 상황의 신호 전달 체계와 일산화질소 전달 체계, 그리고 다이옥신 신호 전달 체계 간에 상호 교신이 존재함을 확인하였다. ; Cytochrome P4501A1 (CYP1A1) is a substrate-inducible microsomal enzyme that oxygenates polycyclic aromatic hydrocarbons. The environmental toxicant 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) is the most potent known CYP1A1 inducers, and it has been known that many categories of chemicals have influence on CYP1A1 induction. In this study, we tried of understand the effects of several chemicals on endogenous CYP1A1 activity in Heap I cells and MCF-7 cells, thus EROD activity was determined. When TCDD administered into Heap I cells, EROD activity was induced in dose and time dependent manner. In Heap I cells, some falconoid, such as methoxsalene, chrysie, myricetin, inhibited TCDD stimulated EROD activity, but Einstein increased the EROD activity stimulated by TCDD was inhibited when glucoorticoid, insulin, biphenyl dimethoxy dicarboxylate (DDB) and dimethoxy dimethoxy monocarboxylate hydrochloride (DDBS) were administered into Heap I cells. In MCF-7 cells, retinue acid and omeprazoke reduced the EROD basal level activity. When estradiol was administered in Heap I cells and MCF-7 cells, EROD activity stimulated by TCDD and EROD basal level activity were reduced. However, this effect was not affected by tamoxifen co treatment, and the metabolites of estuarial showed similar effect with estuarial. SNP (Sodium nitroprusside), which donates nitric oxide, inhibited TCDD stimulated EROD activity. And LPS (lip polysaccharide), which induces iNOS, also inhibited TCDD stimulated EROD activity. N^G-nitro-l argentine (NNA), the inhibited of iNOS, l-Argine was administered concomitantly. To mimic hypoxic condition, cobalt chloride, nicotinic acid and desferrioxamine were administered into Heap I cells. When the iron chelating agents, such as nicotinic acid, desferrioxamine, were administered concomitantly with TCDD, TCDD stimulated EROD activity was reduced in dose dependent manner. Cobalt chloride known as hypoxia inducing agent also inhibited TCDD stimulated EROD activity. NNA, the inhibited of iNOS, recovered the TCDD stimulated induction suppressed in holoxic condition. These data shows that holoxic agents and nitric oxide by TCDD inhibited endogenous CYP1A1 activity stimulated by TCDD in Heap I cells and that the action of hypoxic agents may be mediated by formation of nitric oxide.