P21 tumor protein의 Ca++binding site 확인과 phosphatase 동정에 관한 연구

Abstract

Growth-related tumor protein인 P21은 P23, TCTP (translationally controlled tumor protein), HRF (IgE-dependent histamine releasing factor)라고도 불리며 transcription과 translation 단계에서 모두 조절된다. P21은 1980년대까지 tumor-specific protein으로 그 합성이 tumor proliferation stage와 관련되어 나타난다고 생각했으나 이 후 kidney 또는 renal cell carcinoma를 제외한 모든 정상세포에서도 발현될 뿐 아니라 mammals, higher plants, Saccharomyces등에서도 발견되었으며 거의 모든 종에 있어 높은 homology를 보이고 있으므로 세포 내에서는 없어서는 안 될 house keeping gene으로 중요한 역할을 하리라 추측된다. 172개의 amino acid로 이루어진 P21은 calcium binding protein임이 밝혀졌는데 본 연구에서 deletion constructs를 이용해서 calcium binding site를 알아 본 결과, 3개의 helix-loop-helix 구조 중에서 2,3번째 helix-loop-helix가 위치하는 amino acid residue 81-172가 주로 관여하는 부위임을 알 수 있었다. 다음으로 P21의 탈인산화형이 (Na,K)ATPase와 결합할 수 있으리라는 가능성 아래 P21을 탈인산화 시키는 phosphatase를 알아보기 위해 pull-down assay를 시행한 결과, COS-7 cell protein 중에서 Ca^++이온이 없을 때에는 calcineurin의 19 kDa binding subunit만 결합하지만, Ca^++이온이 존재할 때는 calcineurin의 19 kDa binding subunit과 60 kDa catalytic subunit 모두 결합 함을 알 수 있었다. 이에 P21과 calcineurin의 상호작용을 in vivo 에서 확인하기 위해서 COS-7 cell에 P21을 overexpression 시킨 후 calcineurin inhibitor인 cyclosporin A를 처리하여 2D-electrophoresis를 통한 protein의 변화를 알아볼 계획이다. 만일 P21과 calcineurin의 상호작용이 cyclosporin A의 처리로 저해된다면, P21의 탈인산화에 영향이 미쳐 P21의 2D-PAGE상의 위치 변화를 예상해 볼 수 있기 때문이다. 한편, actin-depolymerizing protein으로 알려진 cofilin은 최근(Na,K)ATPase와의 결합이 확인되면서 제3의 단백질과의 상호작용을 통한 새로운 기능이 있을 가능성이 제시되고 있다. 그러한 기능을 파악하기 위한 실험에서 우선적으로 필요한 항체를 제조하기 위해, pET22-b(+) expression vector에 subcloning하여 얻은 His-tagged cofilin을 affinity chromatography로 순수 분리하였다. 분리한 단백질을 rabbit에 면역화 시켜 얻은 항혈청으로 Western blot을 실시한 결과, polyclonal cofilin 항체가 제조되었음을 확인하였다. ; P21 which if also called as P23, TCTP (translation ally controlled tumor protein) and HRF (lgE-dependen histamine releasing factor) is a growth-related tumor protein. P21 expression is known to be regulated at the level of transcription as well as translation. It was though that the synthesis of P21 was increased at the stage of tumor proliferation. However, since P21 is expressed in normal cells of almost species including mammals, higher plants and Sacchoromyces, it is regarded as a product of house keeling gene. Rat P21 containing of 172 amino acids is known to be calcium binding protein. In this study, I tried to map the Ca^++ -branding site of P21 and found that the amino acid residue 81-172 of rat P21 was able to bind with Ca^++ using deletion constructs. This Ca^++ ?branding domain contains two helix-loop-helix motifs according to the computer simulation model which don’t belong to the Caleb domain neither to the EF hand motif. The rat P21 has a potential protein kinas C phosphorylation side at the residue 98-100 and the possibility was confirmed by the phosphorylation experiment in vitro. Therefore, I attempted to characterize the phosphorylation which specifically dephosphorylation the P21 using pull-down assay. The P21 was able to bind only 19-kDa subunit of calcimining in the absence of Ca^++ but both of 19 kDa and subunit in the presence of Ca^++, suggesting that P21 interacts directly with 19-kDa subunit of calcineurin. In order to develop polyclinic antibody specific to coiling which is acting -depolymerizing protein, coiling gene which was clouded to Pet22-b (+) was over expressed in bacteria. The expressed fusion protein was purified with affinity chromatography and used for the immunization of rabbit. The polyclinic antis era against coiling were produced although they were not specific to coiling.