모세관 전기영동법 및 Maldi-tof mass spectrometry를 이용한 약물 및 peptide성 생체물질에 대한 연구

Abstract

모세관 전기영동법 (capillary electrophoresis, CE)은 극소량의 시료에 대하여 분석이 가능하며 감도와 분해능이 좋고 분석시간이 짧으며 시료나 용매가 적게들어 경제적인 면에서 장점을 갖고 있어 그 응용범위가 넓어지고 있는 새로운 물질 분석기법이다. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)는 분자량이 크고 비휘발성이며 열에 약한 물질에 대해서도 matrix에 의해 이온화가 쉽게 되는 장점을 가지고 있어 펩타이드 및 단백질을 포함한 생체물질에도 응용이 가능한 질량분석법이다. 500,000 Da정도의 고분자량의 물질에 대해서도 적용이 가능하고 생화학 실험에서 사용되는 buffer, salt, denaturant 등에 대하여 선택적으로 tolerant한 특성을 갖고 있으며, 기기의 조작시 별다른 숙련된 과정을 필요로 하지 않는 장점을 가지고 있어 그 응용범위가 다양하다. 최근에는 CE와 MALDI-TOF MS를 동시에 이용하여 펩타이드, 단백질, 당단백질 등의 생분자물질의 분석에 응용하고 있다. 본 실험에서는 CE 및 MALDI-TOF MS를 이용하여 약물 및 peptide성 생체물질의 분석에 관한 연구를 하였다. CE는 광학 이성질체 분석에 여러 장점이 보고된 바 있다. 본 실험에서는 CE를 이용하여 약물의 광학 이성질체의 분석법을 확립하고자 교감신경계에 작용하는 약물들로 catecholamine계 모핵의 약물과 비catecholamine계 모핵의 약물을 선정하여 다양한 β-cyclodextrin유도체를 chiral selector로 사용함으로 구조적 모핵에 따른 약물들간 이성질체의 최적 분리조건을 확립하였다. 이 방법을 이용하여 실제 생체시료에 들어있는 광학 이성질체 분석에 응용하였다. 본 실험에서는 monoamine oxidase (MAO) B inhibitor로 사용되는 selegiline을 투여한 후 일정시간 경과된 사람과 rat의 뇨로부터 그의 대사체인 l(-)-amphetamine과 l(-)-methamphetamine을 분리하였고 따라서 실제 시료중의 약물분석에도 응용이 가능함을 확인하였다. CE는 약물 뿐 아니라 생체물질분석에도 사용될 수 있는데 CE와 최근에 널리 이용되고 있는 생분자물질의 질량분석법인 MALDI-TOF MS를 동시에 사용하여 펩타이드 및 단백질의 구조분석에 응용하였다. 본 실험에서는 CE-MALDI-TOF MS를 이용하여 펩타이드의 카르복실기 말단으로부터 아미노산 서열을 결정하기 위한 분석법을 확립하였다. 먼저 MALDI-TOF MS를 이용하여 분자량이 알려진 합성 펩타이드 adrenocorticotropic hormone (ACTH) fragment 18-39를 사용하여 카르복실기 말단으로부터 아미노산 서열을 동정하고자 salt effect, matrix effect를 고려하여 carboxypeptidase Y를 처리하였을 때 아미노산 서열을 확인할 수 있었고 나아가 CE상에서 75 μm내경의 모세관을 사용하여 분획 분취 (fraction collection)를 실행한 후 분리된 시료에 대하여도 MALDI-TOF MS로 아미노산서열을 확인할 수 있었다. 또한 CE-MALDI-TOF MS를 이용하여 단백질의 구조변화를 monitoring하는 연구가 수행되었는데, metastasis억제와 NDP kinase활성을 가진 recombinant NDP kinase의 구조분석, 아미노산 배열순서, 인산화에 의한 구조변화를 확인하는 분석법을 개발하고자 하였다. 본 실험에서는 NDP kinase에 trypsin, protease V8, cyanogen bromide같은 물질을 처리한 후 CE-MALDI-TOF MS를 이용하여 peptide mapping이 가능하였고, 생성된 펩타이드 절편들로부터 아미노산 배열순서를 확인하고자 시도하였다. 또한 NDP kinase의 기능과 관계된다고 생각되는 인산화에 의한 변화를 관찰하고자 기질로서 ATP를 처리했을 때 구조변화를 확인할 수 있었다. 이로서 다른 생화학적 방법으로는 검출하기 어려운 구조의 변화를 확인 및 동정할 수 있었으므로 CE-MALDI-TOF MS 동시분석법의 응용의 새로운 장을 열었다고 하겠다. 본 연구 결과에 의하면 CE는 약물의 광학 이성질체의 분리분석에 적합하며, CE-MALDI-TOF MS 동시분석법은 펩타이드 및 단백질과 같은 생체물질의 구조분석에 있어서 응용될 수 있어 기존의 생화학적 분석법이 제시하지 못한 유용한 정보를 제공하리라 여겨진다. ; Capillary electrophoresis (CE) is a powerful method for the analysis of various materials because of its speed, high separation efficiency, small volume, and low cost. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) has rapidly developed into a very sensitive and fast MS technique capable of analyzing high molecular masses, up to 500,000, by irradiation of small sample spots. Recently the coupling of both methods is applied for the analysis of various biomolecules. Chiral separation using CE has numerous advantages. In this study, the chiral separation of various sympathomimetic drugs has been carried out by employing the derivatives of β-cyclodextrin as chiral selector. The optimized separation condition was applied for the separation of l(-)-amphetamine and l(-)-methamphetamine to identify as metabolites of selegiline in real urine samples. Tandem analysis of CE with MALDI-TOF MS was performed to analyze the structure of biomolecules such as peptides and proteins. In this study, c-terminal amino acid sequencing of adrenocorticotropic hormone (ACTH) fragment 18-39 using a time dependent carboxypeptidase Y digestion was carried out by off-line coupling CE-MALDI-TOF MS. To optimize MALDI-TOF MS condition, salt effect and matrix effect on the MS signal intensity were investigated. For the fraction collection to isolate ACTH in CE, the capillary with an inner diameter of 75 μm was used. Another application was investigated to analyze recombinant NDP kinase structures. In this study, the peptide mapping of recombinant NDP kinase A (Nm23-H1) has been able due to the Nm23-H1 peptides generated by the enzymatic and chemical cleavage of Nm23-H1 in solutions. Also c-terminal amino acid sequencing of Nm23-H1 peptides was attempted. The structural modification of Nm23-H1 has been monitored by CE and MALDI-TOF MS. These results indicate that CE is an attractive method for chiral separation. Tandem analysis using CE and MALDI-TOF MS is a valuable tool to investigate the structure of biomolecules such as peptide and protein and monitor the structural changes and modifications thought to be related to its functions.