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in vitro상에서 금속이온에 의한 세포사멸에 관한 연구

Title
in vitro상에서 금속이온에 의한 세포사멸에 관한 연구
Other Titles
Research on metal ions as the factors of apoptosis in the cell-free system
Authors
이윤희
Issue Date
1999
Department/Major
대학원 화학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Abstract
세포사멸과정의 세포의 핵에서는 핵막의 분해 및 핵의 수축, 크로마틴의 응집과 genomic DNA의 절편화가 ladder형태로 나타나며 대부분의 경우 DNA 절편화 인자는 세포사멸 인자와 밀접한 연관성을 갖는다. 본 연구에서는 in vitro상에서 금속이온이 핵에 미치는 영향을 알아보았고, 세포사멸 과정의 핵에서 일어나는 변화들, 즉 핵막의 분해와 DNA 절편화를 유도하는 인자를 금속이온 중에서 찾아보았다. Ca^2+과 Mn^2+을 각각 세포질이 없는 조건에서 분리된 핵과 37℃에서 2시간 반응시킨 결과 DNA ladder가 유도되었다. 세포질을 첨가하여 반응한 경우 이러한 절편화는 Ca^2+에서는 약간, Mn^2+에서는 현저히 증가되었다. 이 두 가지 금속에 의해 활성화된 핵 내 DNA 절편화 인자를 규명하기 위하여 여러 가지 단백질 분해효소 저해제를 처리하였는데, 핵이 있는 경우에는 N-tosyl-L-phenylalanin chloro-methyl ketone (TPCK, 100㎛)에 의해 반응이 현저히 저해된 반면 Mn^2+에 세포질을 첨가한 경우 TPCK (100㎛)에 의한 저해는 보이지 않았다. Co^2+는 세포질이 없는 경우 DNA 절단이 미미하였으나 세포질을 첨가하였을 때에 DNA 절편화를 확실히 유도하였다. Co^2+에 의해 유도된 이러한 현상은 β-mercaptoethanol에 의해서 저해된 반면 일련의 단백질 저해제들에 의해서는 변화가 없었다. Co^2+가 활성화한 인자를 조사하기 위해 세포질을 ammonium sulfate로 분획하여 처리한 결과 15% 분획의 세포질에서 반응성이 관찰되었는데 이는 단백질일 가능성이 높다는 것을 의미한다. Zn^2+를 저해제로 처리한 경우, 모든 경우의 DNA 절편화가 저해되었다. 한편 금속이온이 핵막 분해를 유도하는지 알아보기 위해 금속이온을 핵에 처리하고 37℃에서 4시간 반응하였다. Ca^2+을 핵에 직접 처리한 결과 핵막의 분해가 관찰되었다. 이때 세포질에 의한 효과는 불분명하였으나 Mn^2+의 경우는 세포질을 첨가한 반응에서만 핵막의 분해가 나타났으며 Co^2+는 모든 경우에서 핵막에 변화를 주지 못했다. 이상의 결과로부터 Ca^2+과 Mn^2+은 핵 내에 존재하는 chymotrypsin-like protease를 활성화에 이은 DNase의 활성화에 의해 DNA 절편화가 일어났으며 이때 세포질에 의해 DNA 절편화가 촉진된 것은 핵에서의 기작과는 별개의 기작으로 일어난 것으로 사료된다. 이때 Co^2+에 의한 DNA 절편화는 β-mercaptoethanol에 의해 저해된 것으로 보아 Ca^2+이나 Mn^2+과는 다른 경로를 이용하는 것으로 보인다. Ca^2+과 Mn^2+에 의한 핵막의 분해 역시 각기 다른 경로를 이용하여 유도된 것으로 보이며 이런 모든 현상은 세포사멸에서 관찰되는 현상과 유사하였기 때문에 본 연구에서 관찰된 기작을 통한 세포사멸 촉발 기작이 존재하는 것으로 사료되고 그 기작을 담당하는 인자들의 규명은 이후의 연구에서 논의되어야 할 것이다. ; Cells undergoing apoptosis show the characteristic changes in nuclei, such as nuclear membrane degradation, nuclear shrinkage, chromatin condensation, and DNA fragmentation (laddering). In most cases, the DNA degradation factors are activated or induced by the apoptosis-inducing factors. In this study, the factors that induce apoptotic changes, like nuclear membrane fragmentation and DNA fragmentation, in the nuclei from rat liver was investigated using the metal ions. DNA fragmentation was observed when the isolated nuclei were incubated at 37 ℃ for 2 hrs with Ca^2+ or Mn^2+ without cytosolic extract, and with the cytosol the DNA fragmentation effect of Ca^2+ and of Mn^2+ was enhanced. The effect of cytosol was very weak in the case of Ca^2+, and was evident in case of Mn^2+. To characterize the DNA fragmentation factor activated by Ca^2+ and Mn^2+, among the several protease inhibitors, TPCK (100㎛), chymotrypsin-like protease inhibitor, inhibited Ca^2+- or Mn^2+-induced DNA fragmentation in the absence of cytosol, but in the presence of the cytosol the inhibitor did not show the inhibitory effect. There was a limited amount of DNA degradation by the incubation with Co^2+, in the absence of cytosol, whereas the remarkable amount of DNA fragmentation was induced by the cytosol. any of the inhibitors did not inhibit Co^2+ induced DNA fragmentation, except β-mercaptoethanol (2 mM). To characterize the factor that was induced by Co^2+, the cytosolic extract was fractionated using ammonium sulfate precipitation and the 0-15% fraction made the DNA fragmentation which also suggests that the factor is a protein. Zn^2+ almost completely inhibited DNA fragmentation induced by any conditions tested. Nuclear membrane fragmentation was observed after incubation with metal ions for 4 hours at 37℃. Even without cytosolic extract, Ca^2+ induced nuclear membrane fragmentation, whereas cytosolic extract was essential for the nuclear membrane fragmentation in the case of Mn^2+. Co^2+ did not induce the nuclear membrane fragmentation, indicating that this phenomenon may be separable from the DNA fragmentation. From the above results, Ca^2+ and Mn^2+ appeared to activate chymotrypsin-like protease in the nucleus. Probably, then an DNase might be activated by the protease, and subsequently, fragmented DNA. The factor that was activated by the Ca^2+ and Mn^2+ in the nucleus should be different from the factor in the cytosolic extract. There may be the other pathway for Co^2+, because the β-meracptoethanol inhibited the DNA fragmentation induced by Co^2+, but not by other metals. The degradation of the nuclear membrane induced by Ca^2+ and Mn^2+ may proceed through the pathway different from that of DNA fragmentation. All of the features that were induced by those metal ions was similar to apoptotic changes, but they are inhibitable by different agents, strongly indicating the existence of separate pathways. The factors involved in these pathways remains to be isolated and characterized.
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