Identification of domain involved in antagonist binding selectivity of human muscarinic recetpor subtypes expressed in a baculovirus/insect cell system

Abstract

G protein 관련 수용체로 중추와 말초 신경계에서 중요한 역할을 하는 무스카린성 아세틸콜린 수용체는 현재까지 5가지 subtype들 (m1-m5)로 분류되며 이 subtype들은 매개하는 생체 기능 및 ligand들과의 결합 성질이 다르다고 알려졌다. 돌연변이 도입을 이용한 연구들로부터 G protein과 결합하는 부위나 효능제와 결합하는 부위에 대한 정보는 비교적 많으나 길항제 결합 부위에 대한 연구는 부족한 편이다. 본 연구에서는 사람의 무스카린성 수용체 subtype들 (Hm1-Hm3)에 대한 길항제 선택성에 중요한 역할을 하는 부위를 밝히고자 하였다. 이를 위해서 Hm2의 세포막 안쪽의 세 번째 loop (i3)의 C-말단 부위로부터 시작하여 6번째 transmembrane region (TM Ⅵ), o3 loop, TM Ⅶ 및 cytoplasmic C-말단 부위까지를 Hm1의 해당하는 부위로 치환한 chimeric Hm2/m1 수용체와 Hm2의 TM Ⅱ, i3 loop, TM Ⅵ와 o3 loop에 위치하는 일부 아미노산을 Hm1이나 Hm3의 대응하는 아미노산으로 치환한 돌연변이 수용체들을 baculovirus 발현체계를 이용해서 곤충 세포에서 발현시켰다. 이들 수용체들이 발현된 곤충 세포에서 DNA를 분리 정제한 후 정제된 DNA를 기질로 해서 PCR 반응을 행하였고, 이를 통해 DNA 수준에서 수용체 발현을 확인하였고, Northern blot analysis를 통해 재조합 virus에 의해 감염된 곤충 세포에서 해당 수용체의 mRNA가 전사되었슴을 확인하였다. 또한, 재조합 virus로 감염된 곤충 세포의 세포막 시료를 mAChR의 비선택적 길항제인 [^3H]QNB를 이용하여 결합 분석한 결과, 생물학적 활성이 있는 수용체 단백질이 생성되었음을 확인하였다. 수용체의 길항제에 대한 선택적 결합 부위를 규명하고자 [^3H]QNB와 선택적 길항제들의 상경적 결합 분석 (competition binding assay)을 실시하여 wild type과 돌연변이 수용체의 결합친화력을 분석하였다. Hm2의 TM VI에 존재하는 ^401Ala을 Hm1과 Hm3의 대응하는 Thr으로 바꿔준 돌연변이 수용체와, Hm2의 o2 loop에 있는 ^414Ala·^415Pro을 Hm3의 대응하는 아미노산인 ^518Asp·^519Ser으로 바꿔준 돌연변이 수용체는 m1 친화성인 pirenzepine과 m3 친화성인 HHSiD와 4-DAMP에 대해서는 그 친화성이 Hm2에 비해 커졌고, m2 친화성인 methoctramine에 대해서는 Hm2에 비해 친화성이 매우 감소하였다. 이상의 결과로부터, Hm2의 TM Ⅵ에 존재하는 ^401Ala과 이에 대응하는 Hm1의 ^379Thr과 Hm3의 ^505Thr, Hm3의 o3 loop에 존재하는 ^518Asp와 ^519Ser과 이에 대응하는 Hm2의 ^414Ala, ^415Pro이 수용체의 무스카린성 길항제에 대한 선택적 결합에 중요한 역할을 하는 부위라는 것을 밝혔다. 또한 이러한 무스카린성 수용체의 각 subtype들의 특정 아미노산과 이 실험에서 사용한 무스카린성 길항제 사이의 구조적 상관 관계에 대해서는 더 연구되어야 할 것이다. ; Muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs) are G protein-coupled receptors and play key roles in the central and peripheral nervous system. The individual mammalian muscarinic receptor subtypes (m1-m5) have shown to differ in their functional and ligand-binding properties. Whereas considerable progress has been made in elucidating the structural domains underlying G protein coupling and agonist binding, their receptor domains involved in the muscarinic antagonist binding are poorly defined. The present study is aimed to delineate the human muscarinic (Hm) receptor sites which are important in their selective binding of muscarinic antagonists. We constructed chimeric Hm2/m1 receptors in which a region containing a small part of the third intracellular (i3) loop, transmembrane domain (TM) Ⅵ, the third extracellular (o3) loop, TM Ⅶ and the cytoplasmic tail of Hm2 was replaced with the corresponding domains from Hm1. And several mutant receptors in which amino acids of TM Ⅱ, i3 loop, TM Ⅵ, and o3 loop in Hm2 were replaced with corresponding amino acids in Hm1 and Hm3 were constructed by site-directed mutagenesis. These mutant receptors were expressed in heterologous Sf9 cells using baculovirus expression system. We detected recombinant mAChR viral DNA from infected Sf9 cells by PCR analysis and mRNA transcribed in Sf9 cells by northern blot analysis. The binding analysis was done using muscarinic non-selective antagonist [^3H]QNB and the result showed that the mAChR protein retained its binding activity was expressed. To delineate the muscarinic receptor domains which are important in their selective binding of muscarinic antagonists, we performed the competition assay. Replacement of ^401Ala in TM VI of Hm2 with Thr in TM VI of Hm1 or Hm3 and substitution of ^414Ala·^415Pro in o3 loop of Hm2 with ^518Asp·^519Ser in o3 loop of Hm3 increased affinity of a m1-selective antagonist, pirenzepine and a m3-selective HHSiD and a m3-selective 4-DAMP, whereas significantly decreased affinity of the m2-selective methoctramine, compared with affinities of above antagonists for Hm2. The results suggest that ^401Ala in TM Ⅵ of Hm2 and corresponding amino acid of Hm1 and Hm3, ^379Thr and ^505Thr, and ^518Asp and ^519Ser in o3 loop of Hm3 and corresponding ^414Ala and ^415Pro of Hm2 are important structural residues for determining subtype selectivity of muscarinic antagonists. The even putative structural interactions between those specific amino acids in each mAChR subtypes and muscarinic antagonists tested in this study remain to be elucidated.