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인간 태반의 NDP kinase (Nm23)와 변이된 NDP kinase(Nm23-H2)의 기능 및 생화학적 성질에 관한 연구

Title
인간 태반의 NDP kinase (Nm23)와 변이된 NDP kinase(Nm23-H2)의 기능 및 생화학적 성질에 관한 연구
Authors
송은주
Issue Date
1999
Department/Major
대학원 약학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Abstract
Nucleoside diphosphate (NDP) kinase는 nucleoside-5 -triphosphate (NTP)의 말단 인산기를 nucleoside-5 -diphosphate (NDP)로 이동시켜 주는 효소로 아래와 같은 ping-pong mechanism을 통해 일어나며 반응 중간체로 phosphohistidine을 포함한다. N1TP + E ↔ N1DP + E-P N2DP + E-P ↔ N2TP + E NDP kinase의 주된 작용은 NTP를 공급해주어 생체 내에서 필요한 NTP pool의 유지로 생각하였으나 최근 들어 암전이 억제 유전자인 nm23 gene product와 동일하다는 것이 밝혀져 관심이 크게 증가되고 있다. Human NDP kinase는 17 kDa의 polypeptide chain A, B로 이루어져 있으며 각각 nm23-H1, nm23-H2 gene product와 동일하다. Nm23-H1은 암전이 억제 인자로 작용하며 Nm23-H2는 c-myc protooncogene의 nuclease-sensitive element에 결합하여 transcription을 활성화시키는 단백질인 PuF와 동일하다는 것이 밝혀졌다. NDP kinase는 이러한 작용 이외에도 cell proliferation과 differentiation을 조절하며 G-protein과 연관되어 signal transduction에도 관여하는 것으로 알려져 있으나 정확한 기능과 기전에 대해서는 자세히 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 ATP-agarose affinity column chromatography를 사용하여 인간 태반의 cytosol에서 native form의 NDP kinase를 정제하였고 다른 native form인 인간 적혈구에서 정제한 NDP kinase와 association 되어있는 형태, size, 효소의 안정성 등 생화학적 특성을 비교하였다. 또한, 인간 태반을 cytosol, membrane, nucleus로 분획하여 각각의 분획에 존재하는 NDP kinase의 생화학적 특성에 대해 알아보았다. NDP kinase와 다른 단백질들의 관계를 살펴보기 위하여 cytosol, membrane nucleus 분획이 NDP kinase의 효소 활성과 자가 인산화에 미치는 영향을 살펴보았는데 membrane 분획에 의해서 NDP kinase의 자가 인산화가 5배 이상 증가하여 ion-exchange chromatography를 통하여 그 요소를 분리하기 위하여 노력하였다. 인간 태반의 NDP kinase에 관한 연구 이외에도 NDP kinase가 DNA에 결합할 때 중요하게 작용하는 부분을 알기 위해 3 종류의 Nm23-H2 mutant protein인 R34G, N69H, K135L을 만들어 효소의 기본적인 성질을 확인하였고 electrophoretic mobility shift assay (EMSA)를 통해 c-myc promoter에 결합하는 정도를 비교 분석하였다. 연구 결과에 따르면 같은 인간에 존재하는 NDP kinase라도 Nm23-H1과 Nm23-H2의 association 형태와 효소의 안정성 등의 성질이 다름을 알 수 있었고 cytosol, membrane, nucleus의 각 분획에 모두 NDP kinase가 존재하며 특히 membrane 중에는 NDP kinase의 자가 인산화를 증가시키는 요소가 존재함을 확인할 수 있었다. 또한 Nm23-H2 mutant protein을 이용해 DNA binding에 있어서 C-terminal이 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다. NDP kinase의 다양한 기능과 구조, 다른 단백질들과의 연관성 등에 대해서 더 많은 연구가 이루어져야 될 것이다. ; Nucleoside diphosphate (NDP) kinase catalyzes the transfer of the terminal phosphate group of the nucleoside triphosphate (NTP) to the corresponding NDP and has ping-pong mechanism and involves a phosphohistidine as an intermediate of the enzyme. N1TP + E ↔ N1DP + E-P N2DP + E-P ↔ N2TP + E The primary role of NDP kinase in the cell was considered as the maintenance of a pool of nucleoside triphosphate required for the biosynthesis. Recently, the interest of NDP kinase was increased due to their identification as the product of nm23, a putative metastasis suppressor gene. Human NDP kinase is composed of two subunits of 17 kDa polypeptide chain A, B, which are the products of nm23-H1 and nm23-H2. Nm23-H1 acts as a suppressor of metastasis. Nm23-H2 is shown to be identical to PuF, a protein that binds the nuclease-sensitive element on the promoter of c-myc protooncogene and activates the transcription of c-myc in vitro. Also, NDP kinase was suggested having roles in cell proliferation, differentiation and signal transduction associated with G-protein. However, the mechanism in multifunctions of NDP kinase was not illustrated. In this study, at first, we purified native NDP kinase from human placenta using ATP-agarose affinity column chromatography and compared with human erythrocyte NDP kinase on the biological characteristics, for example, the native conformation, molecular weight and stability. Secondly, cytosol, membrane and nucleus from placenta were fractionated. And we investigated the biochemical characteristics of NDP kinase in cytosol, membrane and nucleus. To find out the relationship between NDP kinase and other proteins in cellular fraction, autophosphorylation and enzyme activity of NDP kinase were measured in cellular fractions. Autophosphorylation of NDP kinase was increased more than 5 times by membrane fraction. We tried to isolate autophosphorylation-activating factors of NDP kinase in membrane fraction. Membrane fraction were fractionated by ion-exchange chromatography and about 60 kDa of protein was purified. Beyond human placenta NDP kinase, for identifying the residues responsible to DNA binding properties of Nm23-H2, Nm23-H2 mutant proteins, R34G, N69H and K135L were purified and examined their enzymatic characteristics. The DNA binding properties of Nm23-H2 mutant proteins were investigated with electrophoretic mobility shift assay (EMSA) using c-myc promoter. In conclusion, native conformation, stabilities on placenta NDP kinase and erythrocyte NDP kinase were different though they are in the same species. NDP kinase is distributed in the cytosol, membrane and nucleus. NDP kinase-associated autophosphorylation activating factor exists in membrane. And C-terminal of NDP kinase is important in DNA binding.
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