Characterization of hapten-specific T cell functions in response to altered antigenic ligands

Abstract

한 종류의 T 세포는 항원제공세포에 존재하는 major histocompatibility complex (MHC)와 함께 특정 항원에서 유래된 한 종류의 펩타이드 epitope을 인식한다. 이 경우 T 세포는 제공된 항원을 인식함에 있어 어느 정도의 유연성을 보이는데, 이러한 현상은 아미노산 잔기를 변형시킨 펩타이드 항원에 대한 T 세포의 반응 연구를 통하여 밝혀졌다. 본 연구에서는 특정한 hapten을 인식하는 마우스 T 세포 하이브리도마, 5D10.1B8과 그 항원인 N-hydroxy-succinimidyl-4-azidobenzoate (HSAB) 및 그 유도체들, N-hydroxysuccinimidyl-4-azidosalicylate (HSAS), N-5-azido-2-nitrobenzoyl-oxysuccinimide (ANBS), N-succinimidyl-6-(4 -azido-2 -nitrophenylamino) hexanoate (SANPAH)을 사용하여 기존에 펩타이드 항원 인식을 이용하여 이러한 T 세포 항원인식의 유연성이 펩타이드 뿐만 아니라 hapten에서도 적용될 수 있는지를 접근하였다. 사용된 유도체들은 T 세포에 의해 인식되는 부분에서 그 구조의 차이가 있으며 공통적으로 Lys잔기에 결합하므로 T 세포 수용체에 대해 변형된 리간드로 작용할 수 있었다. 5D10.1B8은 세포표면에 MHC Class II (I-A^d)를 발현하는 항원제공세포에 의해 제공된 HSAB를 인식함이 밝혀져 있으므로, 이를 발현하는 세 가지 종류의 항원제공세포를 이용하여 T 세포가 HSAB를 인식함에 있어서 MHC Class II 분자의 역할을 규명하였다. 또한 glutaraldehyde 와 leupeptin을 항원제공세포에 처리함을 통해 HSAB가 T 세포에 의해 인식되기 위해서는 Lys 잔기에 결합한 후 항원제공세포의 내부로 수송되어 일련의 분해과정을 거쳐야 함을 밝혔다. 5D10.1B8는 항원을 인식하였을 때 IL-2를 분비한다. 따라서 HSAB 및 그 유도체에 대한 T 세포의 활성화 정도를 생성된 IL-2 정도로 측정하였다. 예상대로 항원의 종류에 따라 IL-2 생성 정도의 변화를 보였으며, 특별히 고농도의 HSAB를 처리했을 경우에는 줄어든 IL-2 생성과 함께 cell death가 관찰되었다. 반면 HSAS의 경우에는 HSAB 처리 시에 유도된 IL-2의 약 40% 정도의 IL-2 생성이 유도되었고 다른 유도체에서는 IL-2의 생성정도가 극히 미약함이 관찰되었다. 고농도에서 관찰된 cell death는 propium iodide를 이용하여 관찰했을 때 double stranded DNA의 분해(fragmentation)을 수반함을 알 수 있었으며, 이를 통해 과대한 활성에 의한 cell death (activation induced cell death)임을 추정할 수 있었다. 마지막으로, T 세포는 항원을 인식하였을 때 초기의 신호전달 체계에 있어 신호전달에 관련되는 분자의 tyrosine 잔기의 인산화를 유도함이 알려져 있으므로, HSAB 및 그 유도체를 처리한 후 세포 내부에서 일어나는 변화를 관찰하였다. 이 경우 HSAB 뿐만 아니라 HSAS의 경우에도 인산화가 관찰되었으며, 이를 통해 HSAS가 partial agonist로 작용함을 알 수 있었다. 결론적으로, 이러한 결과들을 통해 5D10.1B8이 HSAB의 미세하게 변형된 구조를 인식함을 규명할 수 있었으며, 이로서 T 세포가 hapten을 인식함에 있어서도 펩타이드 항원에서와 같이 유연성을 가짐을 알 수 있었다. ; Previous studies on T cell responses to altered peptide ligands have provided functional evidences that a T cell receptor can recognize subtle changes in its ligand. Here, the extension of this notion was accessed by examining the response of a hapten-specific mouse T cell hybridoma (5D10.1B8) after being stimulated with specific hapten, N-hydroxysuccin-imidyl-4-azidobezoate (HSAB) and its analogs, N-hydroxysuccinimidyl-4-azido-salicylate (HSAS), N-5-azido-2-nitrobenzoyl-oxysuccinimide (ANBS), N-succinimidyl-6-(4 -azido-2 -nitrophenylamino) hexanoate (SANPAH), which are slightly different in T cell receptor (TCR) contact site but bind to Lys residues on antigen presenting cells (APCs) in the same manner. As 5D10.1B8 recognizes HSAB presented by APCs expressing MHC class II molecules, the role of MHC class II molecules in HSAB presentation and subsequent activation was examined employing three different APCs expressing I-A^d (A20.2JAD, P388D1, and LB27.4). To study the mechanism underlying the presentation of the hapten, HSAB, glutaraldehyde fixation and leupeptin treatment on APCs were performed and the requirement of antigen internalization and subsequent processing was proved. As 5D10.1B8 produces IL-2 when activated, the responses to the various concentrations of HSAB and its analogs were studied. As expected, the recognition of these haptens resulted in different levels of cytokine production, moreover, when treated with high dose of HSAB, activation-induced cell death was examined which was not observed in the other antigens. This phenomenon was confirmed through propium iodide staining followed by flow cytometric analysis and the fragmentation of double stranded DNA was examined. Finally, early response of intracellular signaling events was investigated by comparing protein-tyrosine phosphorylation patterns after stimulating with these haptens and found different patterns of phosphorylation. Altogether, these results demonstrated that 5D10.1B8 could recognize structural differences in its haptenic antigen, HSAB, and provided the evidence that T cell has flexibility in haptenic antigen recognition as well as in peptide antigens.