Soluble amyloid precursor protein 유리 조절기전에 관한 연구 및 사람의 무스카린성 아세틸콜린수용체에 대한 항체 제조

Abstract

Alzheimer s disease (AD)는 임상적으로는 기억력 저하, 인지능력 저하, 주의력 저하, 사고력 저하와 판단력 저하 등의 증상을 나타내고, 병리학적으로는 대뇌피질과 해마 또는 편도핵에서 senile-amyloid plaque와 neurofibrillary tangle이 관찰되어지는 신경퇴행성 질환의 일종이다. AD에서 특징적으로 축적되는 아밀로이드 섬유는 전구단백질인 amyloid precursor protein (APP)의 비정상적인 분해산물인 β-amyloid 혹은 βA4라 불리우는 아밀로이드 펩티드로 구성되어 있고 AD에 있어서 학습과 기억 능력에 손상을 주는 요인으로 작용한다. 이에 반해, 정상적인 세포에서는 APP의 대사 과정중 용해성 아밀로이드 전구단백질 (souble amyloid precursor protein : sAPP)이 세포 밖으로 분비되어 세포 생존, 증식과 부착을 조절하며 신경돌기의 발아 후 생육을 유도하기도 한다. APP를 분해하여 βA4 및 sAPP를 생성시키는 효소들은 아직 규명되어 있지 않으며 βA4 생성과 sAPP 유리 기전에 관해 많은 연구가 이루어지고 있으나 정확한 조절 기전에 대해서는 아직 자세히 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 무스카린성 아세틸콜린 수용체 subtype중 m3를 다량 발현시키고 EGF 수용체를 함유하고 있다고 알려진 신경세포인 SH-SY5Y neuroblastoma cell을 이용하여 sAPP의 유리 조절 기전에 이 두 수용체간의 상호작용에 의한 신호 전달 경로가 관여하는지 조사하고자 하였다. 유리된 sAPP의 양을 측정하기 위한 방법으로 full-length APP (APPFL)의 NH2 말단을 인식하는 monoclonal antibody를 사용하여 western blot을 시행한 후 LAS 1000을 이용하여 정량하였다. 먼저, SH-SY5Y 세포에서 정상적인 대사과정으로부터 sAPP가 세포배양액으로 유리되고, 무스카린성 효능제인 carbachol, protein kinase C (PKC) activator인 PMA와 EGF를 처리하면 sAPP 유리가 더욱 증가되는 것을 확인하였다. 이러한 과정에 Ca^++이 관여하는 지를 Ca^++ chelator인 EGTA를 전처리하거나 약물과 동시에 처리하여 관찰한 결과, mAChR 활성화에 의한 sAPP 유리 증가 효과는 세포 내 Ca^++에 의존적으로 나타나나 직접적인 PKC 활성화 및 EGF 수용체 활성화에 따른 sAPP 유리는 Ca^++과 무관한 것으로 관찰되었다. EGF 수용체가 mAChR 자극에 의해 활성화 (transactivation)되어 mAChR의 기능을 매개한다는 최근의 보고가 있어서 sAPP 유리 증가 기전에 mAChR와 EGF 수용체간의 상호작용에 의한 경로가 관여하는지를 조사하기 위하여 EGF 수용체에 특이적으로 작용하는 억제제를 처리하여 carbachol에 의한 sAPP 유리 증가효과에 대한 영향을 보았으나 큰 변화를 관찰하지는 못하였다. 그러나 SH-SY5Y 세포가 EGF 수용체를 다량 발현하지 않아 24시간 이상의 장시간 처리 효과를 확인할 필요가 있다. 최근에 matrix metalloproteinase인 MMP-9이 βA4의 생성과 분해에 관련되고 따라서 노화와 AD에서의 MMP-9의 기능이 제기되어 본 실험에서는 MMP-9과 sAPP 유리 효과와의 관계를 조사하기 위해 baculovirus/곤충세포 체계를 이용하여 발현시켜 얻어진 MMP-9을 직접 세포에 처리하여 보았으나 큰 변화를 관찰할 수 없었다. 그러나 처리한 MMP-9의 농도가 정확하지 않았기 때문에 MMP-9과 sAPP의 상호 연관성은 더 조사해볼 필요가 있다고 사료된다. 본 실험 목적과는 별도로, 무스카린성 수용체 각 subtype에 대해 선택성을 나타낼 수 있는 항체를 제조하기 위한 목적으로 사람의 mAChR 중 Hm1, Hm2, Hm3의 5번째와 6번째 TM 부위 사이에 위치하여 subtype 간의 유사성이 희박한 third cytoplasmic loop (i3 ; 157-240 amino acids in length)을 pET-32a(+) expression vector에 subcloning하여 E.coli 균주인 BL21(DE3)pLysS에서 thioredoxin (trxA) fusion protein을 발현시키고 순수 분리하였다. Thrombin으로 N-terminal fusion sequence를 제거하여 순수 분리한 단백질을 mouse에 면역화 (immunization)시켜 항혈청 (antiserum)을 얻었다. 얻어진 항혈청을 ELISA와 western blotting을 이용하여 subtype 특이성은 부족하나 titer가 높은 polyclonal mAChR 항체가 제조되었다는 것을 확인하였다. ; Alzheimer s disease (AD), an incurable neurodegenerative condition characterized by a progressive decline in cognitive function defined by a loss of memory, decreased ability to learn, decreased attention span, and a severe compromise in thinking ability, judgement, and decision making. The β-amyloid deposits found in the brains of AD patients are composed of peptides (Aβ) derived by proteolytic cleavage of the amyloid precursor protein (APP). Whereas APP normally undergoes proteolytic cleavage inside the β/A4-sequence, resulting in release of the secreted form of APP (sAPP) into the extracellular space. sAPP has been reported to be involved in the regulation of cell survival, proliferation, cell adhesion, and to induce neurite outgrowth. In the present study, we examine whether the interaction between muscarinic acetylcholine receptors (mAChR) and epidermal growth factor receptor (EGFR) involves in the regulation of the release of sAPP in SH-SY5Y neuroblastoma cells expressing abundant m3 mAChR and EGFR endogeneously. The amount of sAPP secreted from the culture media was quantified by immunoblot analysis with the monoclonal antibody 22C11 which recognizes N-terminal of APPFL. Increase in sAPP released by normal metabolism of APP was detected in control medium in a time-dependent manner, and sAPP release was stimulated by carbachol, a muscarinic agonist, EGF, and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), a PKC activator. The carbachol-induced increase in sAPP release was blocked by EGTA, a Ca^++ chelator, indicating a Ca^++-dependent mechanism. On the other hand, PMA or EGF-induced sAPP release was Ca^++-independent. To explore the effect on sAPP release by cross-talk between mAChR and EGFR, cells were treated with the specific inhibitor of the EGFR kinase activity, tyrophostin AG1478, but significant effect of the agent on carbachol-induced sAPP release was not observed. The possibility for MMP-9 playing as a role of α-secretase was also persued in this study. The addition of MMP-9 protein partially purified from culture medium of Sf9 cells infected with recombinant MMP-9 viruses showed no significant changes in the sAPP release in SH-SY5Y cells. In addition, to develop antibodies specific for the muscarinic acetylcholine receptor (mAChR) subtypes, unique regions of m1, m2, and m3 cDNAs, corresponding to the third cytoplasmic (i3) loops, were subcloned into pET-32a(+), a bacterial expression vector and the fusion proteins were expressed in BL21(DE3)pLysS. The fusion proteins were cleaved by thrombin to separate Hm1, Hm2, or Hm3 proteins from N-terminal fusion sequence. The mice were immunized with each purified proteins and each antisera were characterized by Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) and western blot analysis. The resultant polyclonal antisera against mAChR with high titier were produced although they were not subtype-specific.