항감염성약물의 체내 동태와 세포내 인산화 대사물의 측정

Abstract

The Acquired Immuno-Deficiency Syndrome (AIDS)는 retroviridase에 속하는 lentivirus인 Human Immunodeficiency Virus (HIV)에 의한 면역계 퇴행성 질환이다. Zidovudine (ZDV; 3´-azido-2´3´-deoxythymidine:AZT)은 pyrimidine analog로 최초로 FDA에 승인되어 가장 널리 사용되는 항감염성약물이다. 그러므로 ZDV의 약물 동력학적인 특성과 생체시료 분석법을 기본으로 새로 합성한 상호 이성체인 LJ142와 LJ143의 체내 동태와 분석법을 확립하였다. 1.흰쥐에 ZDV, LJ142 및 LJ143을 20, 18.52 및 18.18mg/Kg을 정맥투여하였을 때, 혈장 중 약물 농도 곡선은 2상성을 나타내었고, 소실상에서의 t_1/2는 151.06, 87.71 및 43.82분, AUC는 1835.84, 1612.66 및 649.83 μg·min/mL, Vd_ss 는 1813.34, 1259.32 및 1530.89 ml/Kg 및 MRT는 166.25, 109.66 및 54.82 분이였다. Cl_t는 10.89, 11.48 및 27.98ml/min· Kg 이였는데, LJ143이 ZDV에 비해1.5배의 유의적인 차이가 있었다(p<0.05). ZDV을 15, 20, 25 및 35mg/Kg으로 각각 정맥주사 하였을 때, AUC_corr이 70.55, 92.18, 125.55 및 182.78μg·min/mL였다. 투여량이 25mg/Kg까지는 parameter간의 유의적인 차이가 인정되지 않았으나, 35mg/kg에서는 parameter간의 유의적인 차이가 인정되었다. 그러므로 투여량 35mg/Kg이상에서는 용량의존성 속도론을 보이고 있다. 역시 LJ143을 투여량 15, 18.18 및 30mg/Kg으로 정맥 투여했을 때, AUC_corr이 28.8, 49.75및 73.61μg·min/mL였다. 투여량이 30mg/Kg일 때의 parameter들간에 대해 유의적인 차이가 인정되므로, 이후로부터 용량 의존성을 보이고 있다. ZDV을 15, 20 및 25mg/Kg로 경구투여 하였을 때, C_max는 16.51, 19.07 및4 1.13mg/mL로 25mg/Kg에서 유의적으로 증가하였다. 또 AUC는 595.91, 1140.35 및 2138.04 μg·min/mL로 25mg/Kg에서 유의적인 증가를 보였다. LJ142와 LJ143을 용량 18.52와 18.18mg/Kg으로 경구투여시 C_max가 12.66과 12.45 mg/mL였다. 또 AUC는 748.97 과 707.29 μg·min/mL를 나타냈다. 생체 이용률을 보면 ZDV은 61.94%, 상호 이성체인 LJ142와 LJ143은 46.44와78.24 %로, LJ143이 유의적으로 1.3배 컸다. 2. ZDV과 같은 염기유도체인 항감염성 약물은 세포내로 들어가 인산화 효소에 의해 인산화되어 viral DNAelongation을 제해해야 약효를 나타낸다. 실제적인 약효 농도를 결정하고 독성을 줄이기 위해서는 활성형인 인산화 대사체의 세포내 농도를 결정해야 하므로, 사람 혈액에서 PBMCs를 분리해 ZDV과 배양시켜 전체 ZDVP를 ^125I-ZDV Trac를 사용해 RIA로 분석하였다. Tris/MgCl_2 buffer (pH9,5)는 고농도나 저농도 모두에서 CVs가 약 3%로 큰 영향을 주지 않았다. AP는 고농도에서는 CVs 2.6%로 영향이 적으나 저농도에서는 CVs 7.9%로 유의적인 차이가 인정된다. AP에 의한 ZDV으로의 전환률은 고농도나 저농도 모두 95.6과 82.3 %로 실험 과정 중의 손실 10%가량을 빼주면 좋은 활성을 갖는다. 재현성은 고농도에서는 control과 세포추출액의 CVs가 10.7 및 15,6%로 고농도에서의 AP처리는 적합하다고 할 수 있다. 그러나 저농도에서의 CVs는 31.0 및24.8%로 AP에 의해 RIA variability가 증가되는 것을 알 수 있었다. 세포외ZDV의 농도와 세포내의 전체 인산화된 ZDV의 농도와의 상관성과 측정을 위한 실험에서 농도 의존적인 비선형 용량-반응 곡선을 나타내었다. PBMCs에ZDV을 0.015∼2.996 mM로 적용한 결과 0.135±0.114∼5.019±0.3 nmole/10^6 cells의 세포내 인산화 ZDV 농도를 나타내었다 ; In order to assay the efficacy of newly synthesised antiviral compounds, pyrimidine analogs, pharmacokinetics of those and in vitro studies of their active intracellular phosphorylated metabolites were established as compared with zidovudine (ZDV). 1. ZDV (15, 20, 25 and 35mg/kg), LJ142 (18.52mg/kg) and LJ143 (15, 18.52 and 30mg/kg) were injected orally and intravenously in rats, samples were collected postinjection(i.e., for 360 min) in blood. Those were analyzed by means of HPLC with UV detection at 265nm. Phamacokinetic parameter (C_max, t_1/2, MRT, AUC, AUMC, Vd_ss, Cl_t) were calculated with the results. The pharmacokinetic parameters of ZDV and LJ143 following IV dosing of 15∼25mg/kg and 15∼18.18mg/kg were dose-independent. However, the pharmacokinetic parameters of ZDV and LJ143 following IV dosing of 25∼35mg/kg and 18.18-30mg/kg were dosedependent. The extents of bioavailability following oral administration were 61.94, 46.44 and 78.24%. 2. Antiviral base analoges requires intracellular phosphoryation prior to the inhibition of HIV replication. Therefore, to determination the intracellular levels of the active form because measurement of antiviral drugs concentrations in plasma have not reflected any direct relationship with activity or toxicity. A method has been developed to measure the concentration of total phosphorylated metabolites inside peripheral blood mononuclear cells using modified commercial radioimmunoassay (RIA). Theirs 5 -monophosphates were synthesized and used as a procedural control for RIA modification. PBMCs were isolated from whole blood and incubated with ZDV for 20 h to allow metabolic phosphorylation. Viable cells were extracted overnight with 60% methanol. After evaporation, the extract was reconstituted in Tris buffer. Samples were split into two fractions, one of which was treated with alkaline phosphatase (AP) to liberate phosphate groups. Concentrations of phosphorylated metabolites were determined by subtracting the concentration of non-APtreated fraction from that of the treated fraction. Recovery of phosphorylated ZDV from cell extracts was approximately 90%, and reproducibility was acceptable (coefficients of variation ＜15% for concentrations ≥0.25ng/mL). Intracelluler concentrations (0.1355∼5.019nmole/10^6 cells) followed a nonlinear dose-response relationship over the range 0.015 2.996 mM extracellular ZDV, with concentration-dependent saturation.