In vivo 및 in vitro 시험계를 이용한 수종 화학물질의 간독성 관련 유전자 발현에 관한 연구

Abstract

간질환 치료제인 biphenyl dimethoxy dicarbonate (DDB), 다환상 방향족 화합물인 3-methylcholanthrene (3MC), 내분비 장애 물질로 의심되고 있는 dibutyl phthlate (DBP), 그리고 위궤양 치료제로 사용되는 omeprazole이 간독성 관련 유전자 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 in vivo 시험계로 실험동물인 웅성 백서, rhesus 원숭이(Macaca mulatta) , cynomologus 원숭이(Macaca fascicularis)를, in vitro 시험계로써 생쥐의 간에서 유래한 Hepa-I 세포, 사람의 간암 세포인 HepG2 세포를 사용하여 실험하였다. DDB는 CYP2B1 mRNA와 BROD 활성을 3일째 최고 유도 효과를 보였고, 용량이 증가함에 따라서 그 효과가 증가하였다. 생쥐 간 세포인 Hepa-I 세포에서, EROD 활성과 luciferase 활성을 측정 하였을 때, DDB는 활성 증가, TCDD에 의해 증가된 활성의 억제 효과 모두 관찰되지 않았다. 그리고, 간독성 유발물질인 CCl4를 투여 했을 땐 CYP2B1 mRNA와 BROD 활성을 감소 시켰는데이는 CCl4에 의한 간세포 파괴에 기인한다고 생각되어지며, DDB는 이렇게 감소된 CYP2B1 mRNA 와 BROD 활성을 용량 의존적으로 증가시켰다. Rhesus 원숭이(Macaca mulatta)의 간에서의 basal CYP1A1 mRNA 는 나이가 증가함에 따라서 증가하는 경향을 보였고, basal CYP1A1 mRNA를 장기별로 비교하였을 때, 소장에서 가장 높고, 그 다음은 뇌, 간의 순서로 높았고, 3MC를 투여했을 때는 간에서 가장 높은 CYP1A1 mRNA 유도 효과가 보였고, 반면에 소장에서는 가장 낮은 효과가 보였다. Rhesus 원숭이에서 GST α, μ, π의 basal mRNA는 모두 소장에서 가장 많았고, 3MC 처치 했을 때는 GSTa와 μ의 mRNA는 간에서 가장 많이 유도되었으며 GST π의 mRNA는 뇌에서 가장 많이 유도 되는 것으로 나타났다. 임신한 cynomologus 원숭이에 3MC와 DBP를 투여한 결과 3MC를 처치했을 때는 어미와 태아에게서 모두 CYP1A1 mRNA와 EROD 활성 증가가 나타났으나, DBP는 어미에게서만 CYP1A1 mRNA와 EROD 증가 효과가 나타났고, 태아에게서는 효과가 없었다. 이 결과로 3MC는 cynomologus 원숭이에 있어서 CYP1A1 유도제이고 그 효과가 태아에게도 미치나, DBP는 태아에게서는 아무런 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다. Omeprazole은 Hepa-I 세포에서 pmCyp1a15´-Luc plamid를 transfection 시켜서 전사 활성을 보았을 때 효과가 없었던 반면에 HepG2 세포에서는 용량 의존적으로 CYP1A1 mRNA를 증가시켰고, 그 효과도 비교적 강력하였다. Omeprazole에 의해서 증가되었던 CYP1A1 mRNA 는 AhR의 부분적 길항제인 α-NF 병용 처치시, TCDD에 의한 CYP1A1 mRNA 유도 감소 효과가 나타나는 10-6 M 에서는 감소하지 않았고 10-5 M에서 감소가 일어났고, 반면 tyrosine kinase 저해제인 genistein을 병용처치했을 때는 감소가 일어났다. 이것으로 omeprazole에 의한 CYP1A1 mRNA 유도 작용은 tyrosine kinase를 통한 인산화와도 관련이 있고, AhR과의 결합도 관여 할 수 있을 것으로 생각되어진다. ; DDB, a therapeutic agent for hepatic disease, 3MC, a polynuclear aromatic hydrocarbon, DBP, a suspected endocrine disruptor, and omeprazole, a therapeutic agent for peptic ulcer was investigated for hepatic toxicity related gene expression using in vivo and in vitro experimental systems. DDB induced CYP2B1 mRNA and BROD activity dose dependently and the level of CYP2B1 mRNA and BROD activity reached maximal level by 3 days in rat liver. In Hepa-I cells, DDB had no effect on the level of EROD activity and luciferase activity. DDB increased CYP2B1 mRNA and BROD activity on CCl₄treated rat liver in dose dependent manner. In rhesus monkey (Macaca mulatta), the basal level of CYPIA1 mRNA in liver was increased as the age increased and the basal level CYPIA1 mRNA was high in intestine, intermediate in brain, and low in liver. The inducibility of CYPIA1 mRNA by 3MC in rhesus monkey was high in liver and low in intestine. The basal levels of GST α, μ, π mRNA was high in intestine and the inducibility of GST αand μ mRNA by 3MC was high in liver, and the inducibility of GST π mRNA by 3MC was high in brain. In pregnant cynomologus monkey (Macaca fascicularis), 3MC induced CYPIA1 mRNA and EROD activity both in mother and fetus. But DBP induced CYPIA1 mRNA and EROD activity only in mother. Omeprazole had no effect on Cyplal inducibility in Hepa-I cells based on luciferase activity. But in HepG2 cells, omeprazole induced CYPIA1 mRNA significantly and the effect of omeprazole on CYP1A1 mRNA was dose dependent. α-Naphthoflavone, a partial AhR antagonist didn t inhibit the omeprazole induced CYPlA1 mRNA level but, high dose of α-NF inhibited the omeprazole induced CYPIA1 mRNA level in HepG2 cells. Genistein, a tyrosine kinase inhibitor, inhibited the omeprazole induced CYPIA1 mRNA level. It is concluded that mechanisms of omeprazole induction of CYP1A1 mRNA include phosphorylation by tyrosine kinase and binding of AhR.