흰쥐 뇌에서의 LPS-유도 산화적 스트레스에 대한 nitric oxide synthase와 guanylyl cyclase저해제들의?謗?및 quinone유도체들의 쥐 혈관 이완 억제 효과

Abstract

Nitric oxide (NO)는 생체 내 여러 조직에서 neuronal, inducible, endothelial NO synthase (NOS)에 의해 생성되어 세포 내 cyclc GMP 의존성 경로를 통해서 신호조절 분자로서 중요한 세포 내 기능에 관여할 뿐 아니라 산화적 스트레스를 유발시켜 세포독성을 나타내기도 한다. Lipopolysaccharide (LPS)는 특히 inducible NOS의 합성을 유도하여 여러 가지 염증성 cytokine과 NO의 농도를 증가시킨다. 뇌 내에서의 NO는 중요한 생리기능을 조절할 뿐만 아니라 superoxide (O₂^˙^-)와 반응하여 peroxynitrite radical (ONOO^-)의 형성 등의 신경독성을 유발하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 먼저 LPS의 쥐의 복강 투여에 의해 뇌 조직내의 활성 산소종(reactive oxygen species; ROS)의 생성과 지질 과산화 (lipid peroxidation) 등의 산화적 스트레스의 변화가 관찰되는 지 뇌 부위 별로 조사하였다. 뇌 조직내 산화적 스트레스는 활성 산소 중 2 ,7 -dichlorofluorescin diacetate (ROS) 측정과 thiobarbituric acid (TBA) 분석법을 이용한 지질 과산화를 측정함으로서 관찰하였다. 본 연구에서 흰쥐의 복강으로 LPS를 1 mg/kg와 2 mg/kg의 농도로 투여하고 투여 6 시간 후에 적출된 뇌의 선조체, 해마 및 대뇌 피질에서 모두 LPS의 농도 의존적으로 ROS의 생성과 지질 과산화가 증가되었다. 따라서 이 실험조건 (LPS 투여경로 및 농도와 투여시간)에서 LPS에 의해 쥐 뇌 조직에서 유의적인 산화적 스트레스가 유발된 것을 확인하였다. NOS 저해제, guanylyl cyclase (GC) 저해제, 새로운 fluorinated phenylamino quinone 합성체로서 GC와 NOS 억제작용을 모두 나타내는 것으로 최근 알려진 OQ21과 항산화작용이 있다고 알려진 melatonin을 쥐의 선조체로 직접 투여하여 LPS로 유도된 산화적 스트레스 변화에 대한 영향을 조사하고자 하였다. LPS 처리군과 처리하지 않은 대조군에서 모두 GC 특이적 저해제인 1H-[1,2,4]oxdiazolo[4,3,-a]quinoxaline-1-one (ODQ), NOS 저해제인 diphenyleneiodonium (DPI) 또는 N-nitro-L-ar ginine (NAME)를 선조체 내투여하였을 때 유의성 있는 ROS의 변화를 관찰하지 못하였다. OQ21은 대조군에서는 ROS 생성에 대한 변화를 나타내지 않았으나 LPS 처리군에서는 LPS에 의한 ROS의 증가 효과를 더욱 강화시켰다. 이 OQ21에 의한 ROS 증가효과는 항산화제로 알려진 melatonin과의 동시투여에 의해 다시 대조군의 수준으로 회복되었다. 이 결과들로부터 LPS는 blood brain barrier를 통과하여 뇌에 산화적 스트레스를 일으킬 수 있다는 것을 알 수 있었으며 LPS에 의한 ROS의 증가는 활성화된 NOS로 인해 생성된 NO의 작용만으로 일어나는 것이 아니며 다른 경로를 통하여도 ROS가 증가될 수 있으므로 NOS 와 GC의 저해만으로는 ROS 생성에 영향을 미치지 못하는 것이라고 추측되며 OQ21은 DPI, NAME, 등의 다른 NOS 저해제들과는 달리 NOS에 상호작용하여 자신이 NOS에 의해 환원되어 superoxide를 형성하는데 LPS로 인해NOS가 과도하게 유도가 되어 OQ21에 의해 충분히 억제되지 않는 NOS가 OQ21과 반응하게 되어 LPS에 의해 ROS 증가효과를 더욱 강화 시키는 작용이 나타났을 것이라 추측된다. 한편 내피에서 분비되는 혈관이완인자인 NO는 세포내에 acetylcholine(ACh) 과 같이 Ca^2+의 유입을 증가시키는 물질들에 의해 endothelial NOS 가활성되어 합성된다. 이렇게 합성된 NO는 이웃한 평활근 세포로 쉽게 확산되어 세포내에 있는 GC를 활성화시켜 cGMP를 증가시키게 되로 이로 인해 단백질의 인산화 반응이 촉진되면서 평활근의 이완반응이 나타나게 된다. 본 실험실에서는 NOS를 억제함으로써 NO의 과도한 생성을 차단하며 NO의 생리적 수용체인 GC를 억제하여 혈관이완을 억제하는 화합물을 개발하고자 혈관이완 억제력이 예측되는 quinone 화합물들을 스크리닝 해왔다. 본 논문 실험에서는 새로 합성된 quinolinedione 유도체(OQs)와 이에서 변형된 isoquinolinedione 유도체(IQOs)에 대하여 흰쥐의 적출 흉곽대동맥을 이용한 organ bath 실험을 통해 내피의존성 혈관이완에 대한 억제작용을 일차적으로 스크리닝하여 혈관이완 억제력이 우수한 물질을 찾아내고 ACh에 대한 이완을 억제하는 정도를 조사하였고, OQ21, IQO3, IQOl0이 강력한 ACh에 의한 내피의존적 혈관이완에 대한 억제효능을 나타내는 것을 확인하였는데 OQ21과 IQO10은 모두 2,3,4-trifluorophenyl로 치환된 물질이었으며 IQO3는 본 실험실에서 이전에 효과가 있다고 확인된 OQ1과 같은 위치의 4-fluorophenyl로 치환된 물질임을 알 수 있었다. OQ21의 혈관 억제기전을 부분적으로 밝히고자 NOS의 reductase 부위에 결합하여 NOS를 저해하는 물질로서 알려진 DPI를 단독 또는 DPI와 OQ21의 병용 투여시 효과를 조사하였는데 병용 투여시 OQ21의 혈관이완 억제능에 DPI가 아무 영향을 나타내지 않았다. 이 결과 이전의 실험으로 밝혀진 NOS의 oxygenase 부위에 결합하여 NOS를 저해하는N-nitro-L-arginine (NNA) 와 OQ21의 병용투여에 의한 상승 효과와 비교해 볼 때 OQ21이 NOS의 reductase 부위에 상호 작용하여 NOS를 저해한다고 예측할 수 있었다. ; Lipopolysaccharide (LPS) induces synthesis of several inflammatory cytokines and nitric oxide (NOS) eliciting an elevation of NO. NO in brain is implicated not only in the regulation of important metabolic pathways via intracellular cyclic GMP-dependent pathways, but also involved in neurotoxic damage by reacting of NO with superoxide (O₂) to form peroxynitrite radical (ONOO). On the other hand, oxidative stress has been suggested to be related to inhibition of NOS/cyclic GMP pathway. The first set of experiment in this study was designed to examine the effect of NOS induction by LPS together with or without inhibitors of nitric oxide synthase (NOS) or guanylyl cyclase (GC) was examined for its effect on oxidative stress produced in rat brain. Oxidative stress was observed by using the 2 , 7 -dichlorofluorescin diacetate to measure intracellular reactive oxygen species (ROS) production and by measuring the formation of thiobarbituric acid (TBA) reactive substances to measure lipid peroxidation. LPS induced significant increase in both ROS produdction and lipid peroxidation in all brain regions treated (striatum, hippocampus and cortex) which were dissected 6 hr after the administration (i.p.) of LPS to rats. Direct intrastriatal injection of a new fluorinated quinone compound, OQ21 enhanced ROS formation in striatal tissues from LPS treated rats. Whereas striatal injection of two other NOS inhibitors, N-nitro-L-arginine methyl ester(NAME) and diphenyleneiodonium (DPI) or a guanylyl cyclase inhibitor, 1H-[1,2,4] oxadiazolo[4,3-a]quinoxaline-l-one (ODQ), produced no significant ROS increase. Melatonin decreased ROS formation in striatum from LPS treated rats, and furthemore, melatonin recovered ROS formation increased by OQ21 in striatum from LPS treated rats. Vascular smooth muscle is relaxed by NO which synthesized NOS and stimulate soluble GC, the key enzymes involved in vascular smooth muscle relaxation. The second set of experiment in this study was performed to screen and investigate the inhibitory effects of newly synthesized quinone derivatives on relaxation of isolated rat aorta rings in organ bath experiments. Through the screening experiments for the inhibitory effect of newly synthesized quinone derivatives on ACh-induced endothelium dependent relaxation, OQ21, IQ03 and IQO10 showed signigicant inhibitory effects on the vasodilation. Next, to pursue the possible mechanism of the OQ21, OQ21 together with DPI which known as inhibitor of reductase domain of NOS showed no additive or synergic inhibitory effect on vasodilation. This result opposite to previous OQ21 together with N-nitro-L-arginine which known as inhibitor of oxygenase domain of NOS showed additive or synergic inhibitory effect on vasodilation. Futher study are required to investigate the precise mechanism of the compounds.