정상백서 췌장소도세포 분비과립에서 prostaglandin E2에 의한 백일해 독소민감형 guanine nucleotide결합단백질 활성의 조절

Abstract

Phoshpolipase A_2산물인 arachidonic acid의 대사물 prostaglandin E_2는 시험관 내와 생체내에서 정산 췌장소도세포의 인슐린 분비를 억제하며 이는 백일해 독소 (pertussis toxin)의 처치에 부분적으로 회복되어 Gi, Go단백질 등의 heterotrimeric guanine nucleotide 결합단백질 (이하 G단백질)을 통하여 작용할 것으로 추정된다. 과거 이러한 heterotrimeric G 단백질은 췌장소도세포의 세포막에서 주로 작용하여 인슐린의 분비를 조절할 것으로 생각되어 왔으나 최근 인슐린의 분비를 증가 시키는 인지질들이 세포막은 물론 분비과립에서도 G 단백질의 활성을 조절하여 분비과립 자체에서 G 단백질의 존재가 증명되어 이들 G단백질이 분비과립에서 인슐린의 세포 외 분비에 관여될 것으로 추정된다. 본 연구는 정상 백서의 췌장소도세포 특히 인슐린의 세포 외 방출과 연관된 분비과립에서 heterotrimeric G 단백질의 존재와 이들의 prostaglandin E_2(PGE_2)에 의한 활성의 조절을 규명하여 PGE_2가 분비과립과 같은 세포 내 위치에서 인슐린의 분비에 영향을 줄 수 있는지 알아보고자 하였다. Sprague-Dawley쥐의 췌장소도를 분리하여 세포의 분획화를 시행후 분비과립에서 ADP-ribosylation으로 백일해 독소 과민형 G 단백질의 존재를 증명하고, [γ- `^32 P] GTP를 이용하여 GTPase활성도와 [γ- `^35 S] GTPγS를 이용하여 GTP결합을 측정하였으며 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 정상백서의 소도세포 분비과립에는 분자량 39KDa의 ADP-ribosylated기질이 존재하였다. 2. PGE_2는 농도에 의존하여 저 Km GTPase활성은 최대 80.4%, 고 Km GTPase활성은 최대 42.3% 증가시켰고, 고친화성 저 Km GTPase에 대한 활성의 증가정도가 더 현저하였고 베타 세포주 및 췌장소도세포에서 인슐린의 분비를 억제한다고 알려진 800nM의 농도에서 반최대(half maximal) 자극을 보였다. 3. PGE_2와 함께 epinephrine, clonidine등의 인슐린 분비 억제물질과 G 단백질을 활성화하는 peptide인 mastoparan 도 GTPase의 활성을 증가시켰고 이들에 의한 저 Km GTPase의 활성의 증가는 백일해 독소의 전처치에 의해 완전히 회복되었다. 4. 각종 prostanglandin (PGA_2, PGB_2, PGD_2, PGF_2) 중 PGE_2만 GTPase의 활성을 증가시켰다. 5. PGE_2는 GTPγS의 결합은 변화시키지 않았다. 이상의 결과에서 정상백서의 췌장소도세포 분비과립에 백일해 독소과민형 heterotrimeric G단백질이 존재하고 PGE_2는 분비과립의 저 Km GTPase의 활성을 자극하여 인슐린 분비억제 작용을 나타낼 것으로 생각된다. ; Prostaglandin E_2(PGE_2), a major metabolites of arachidonic acid generated by activation of phospholipase A_2 in pancreatic islets, inhibits glucose induced insulin secretion in vivo and in vitro and these effects of PGE_2 are largely reversible by pertussis toxin, suggesting a possible involvement of Gi or Go-like proteins. Author undertook this study to investigate the presence of regulatable heterotrimeric G-proteins and their regulation by PGE_2 on secretory granule in normal rat pancreatic islets. After isolation and subcellular fractionation of pancreatic islets from Sprague-Dawley rats, ADP ribosylation to identify pertussis toxin sensitive heterotrimeric G-protein, measurement of GTPase activity and GTP binding were performed. The results were as follows, 1. Typical pertussis toxin sensitive ADP-ribosylated substrate with Mr 39KDa was identified in normal rat islet secretory granule. 2. PGE_2 stimulated a high affinity low Km and a low affinity high Km GTPase activity in the normal rat islet secretory granule in a concentration dependent manner and these effect was more prominent on the high affinity low Km GTPase. Half maximal stimulation was demonstrable at 800nM PGE_2, a concentration known to inhibit both phases of glucose-induced insulin secretion from pure beta cell lines. 3. PGE_2 as well as other inhibitors of insulin secretion(such as epine-phrine or clonidine) and mastoparan also stimulated GTPase activity and these effects were recovered by pertussis pretreatment. 4. Of the five prostaglandins (PGF_2, PGA_2, PGD_2 and PGB_2) only PGE_2 stimulated GTPase activity significantly. 5. PGE_2 had no effects on GTP binding. These results suggested that in secretory granule, regulatable pertussis toxin sensitive heterotrimeric G-proteins were present and PGE_2 might represent their action via regulation of low Km GTPase activity.