Interleukin-1β가 사람의 복막 중피 배양세포에서 MCP-1과 RANTES생성에 미치는 영향

Abstract

복막은 여과막일 뿐 아니라 염증의 일차 방어선이다. 숙주의 방어기전이 깨어져 복막염이 발생되면 세균에 의해 자극받은 대식세포에서 proinflammatory cytokine이 분비되고 proinflammatory cytokine의 자극에 의해 다시 대식세포, 복막 중피세포, 복막 섬유아세포 등에서 여러 종류의 cytokine, chemokine, 성장인자 및 유착분자 등이 분비되어 복강 내에는 복잡한 cytokine network가 형성되게 되며 이들 network에 의해 염증과정이 조절될 것으로 생각되고 있다. 이 중 chemokine은 주화성 경사도를 형성하여 염증세포를 복강 내로 유도하고 염증과정을 증폭시키는 것으로 알려져 있다. 1990년대 들어 복막염 시 복강 내에서 발견되는 여러 cytokine 및 chemokine이 복막 중피세포에서도 분비될 수 있음이 밝혀짐에 따라 복막염의 염증과정에서 복막 중피세포의 역할에 대한 관심이 높아지고 있다. C-X-C chemokine에 속하는 interleukin-8 (이하 IL-8이라 칭함)은 복막염 시 복막 중피세포에서 생성되어 중성구의 주화성에 관여함이 밝혀졌으나 단핵구의 주화성에 관여하는 monocyte chemotactic protein-1 (이하 MCP-1이라 칭함)이나 regulated upon activation normal T cell expressed and secreted (이하 RANTES라 칭함)와 같은 C-C chemokine이 복막 중피세포에서 생성되는 지의 여부는 아직 확실히 밝혀져 있지 않다. 이에 본 연구에서는 사람의 복막 중피 배양세포에서 proinflammatory cytokine인 interleukin-1β (이하 IL-1β라 칭함)와 tumor necrosis factor-α (이하 TNF-α라 칭함) 및 세균의 세포벽에 존재하는 proinflammatory 성분인 lipopolysaccharide (이하 LPS라 칭함)에 의해 MCP-1과 RANTES가 생성되는 지를 알아보고 이들 chemokine이 단핵구 주화성에 미치는 기여도를 평가하고자 하였다. 복막 중피세포는 사람의 장간막을 trypsin으로 처리하여 분리, 배양하였고 계대배양 3회째의 세포를 실험에 사용하였다. 배양된 복막 중피세포를 IL-1β( 1.0 ng/ml), LPS (1.0 μg/ml) 및 TNF-α (10 ng/ml)로 6시간 동안 자극하여MCP-1 및 RANTES messenger RNA (이하 mRNA라 칭함)의 발현을 Northern blot 검사로 확인하였고 특히 IL-1β 자극시간 및 자극농도에 따른 MCP-1 및 RANTES mRNA의 발현을 관찰하였으며 mRNA의 발현에 따른 MCP-1 및 RANTES 단백의 생성을 알아보기 위해 1.0 ng/ml의 IL-1β로 24시간 자극한 배양 상층액에서 MCP-1 및 RANTES의 농도를 효소결합면역흡착검사를 이용하여 측정하였다. 또한, 1.0 ng/ml의 IL-1β로 24시간 자극한 배양 상층액에 대한 단핵구의 주화성을 알아보기 위해 주화성검사를 시행하였고 IL-1β 자극에 의해 증가된 단핵구의 주화성 중 MCP-1과 RANTES의 기여도를 평가하기 위해 항 MCP-1 항체와 항 RANTES 항체로 자극한 상층액과 반응시킨 후 주화성검사를 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 배양된 세포는 위상차현미경 소견에서 복막 중피세포의 특징적인 소견인 polygonal한 형태를 보였으며 간접면역형광염색 소견에서도 항 cytokeratin 항체 및 항 vimentin 항체에 대해 세포질이 균일하게 염색되는 양성반응을 나타내어 복막 중피세포임이 확인되었다. 2. IL-1β (1.0 ng/ml), LPS (1.0 μg/ml) 및 TNF-α (10 ng/ml)로 자극 시 복막 중피세포에서 MCP-1 및 RANTES mRNA의 발현이 증가되었다(n=2). 3. IL-1β (1.0 ng/ml) 자극시간 경과에 따른 MCP-1 mRNA의 발현은 자극하지 않은 대조군에 비하여 자극 1시간, 3시간, 6시간 및 24시간 후에 각각 4.2±0.1배, 8.9±0.6배, 4.4±0.6배 및 3.9±0.5배로 증가하였고, 시간 경과에 따른 RANTES mRNA의 발현은 각각 1.3±0.3배, 2.3±0.4배, 2.2±0.7배 및 1.4±0.2배로 증가하여 IL-1β로 자극 3-6시간에 가장 많이 증가하였다가 이후 감소하는 추세를 보였다(p<0.05, n=3). 4. IL-1β 0.01 ng/ml부터 5.0 ng/ml까지의 농도로 6시간 자극 시 복막 중피세포에서 자극농도에 따른 MCP-1 및 RANTES mRNA의 발현은 농도에 비례하여 증가되었다(n=2). 5. IL-1β (1.0 ng/ml)로 24시간 자극한 배양 상층액에서 MCP-1 단백 생성량은 30.0±2.22 ng/105세포로 대조군에서의 3.55±0.74 ng/105세포에 비해 유의하게 많았고 RANTES 단백 생성량도 IL-1β로 자극한 군에서 1.53±0.41 ng/105세포로 대조군에서의 0.11±0.02 ng/105세포보다 유의하게 많았다(p<0.05, n=6). 6. IL-1β (1.0 ng/ml)로 24시간 자극한 배양 상층액에 대한 단핵구의 주화성은 71±3.4%로 자극하지 않은 군에서의 50±2.9% 및 배양액 자체에서의 15±2.1%에 비해 유의하게 높았다(p<0.05, n=6). IL-1β로 자극한 상층액에 항 MCP-1 항체 및 항 RANTES 항체를 각각 첨가하여 반응시킨 후 시행한 주화성검사에서 단핵구의 주화성은 각각 47±3.1%와 62±3.0%로 항체와 반응시키기 전보다 33% 및 12% 억제되었다(p<0.05, n=6). 이상의 결과에서 복막 중피 배양세포에서도 IL-1β, LPS 및 TNF-α의 자극에 의해 MCP-1 및 RANTES mRNA가 발현되었고 특히 IL-1β 자극에 의한 MCP-1 및 RANTES mRNA의 발현은 자극시간 및 자극농도에 비례하여 증가되었으며 이러한 mRNA의 발현에 따라 MCP-1 및 RANTES 단백 생성도 증가됨을 확인하였다. 또한, 기능적으로도 복막 중피세포에서 생성된 MCP-1 및 RANTES가 주화성 경사도에 의해 단핵구의 주화성에 직접 관여함을 알 수 있었다. 이는 복막염 시 복막 중피세포에서도 세균 자체 혹은 대식세포에서 주로 생성되는 proinflammatory cytokine에 의해 여러 chemokine이 생성되고 이들 chemokine이 다시 염증 세포의 복강 내 유입을 증가시킴으로써 염증과정이 증폭될 것으로 생각되며 이러한 상호 작용을 통하여 복막 중피세포도 복막염의 병태 생리학적 기전에 중요한 역할을 담당할 것으로 생각된다. ; Peritoneal membrane forms the primary defense barrier during peritoneal infection. Human peritoneal mesothelial cells have a great potential to secrete chemokines, growth factors, adhesion molecules, and various cytokines stimulated with proinflammatory cytokines during peritoneal infection and are thus capable of contributing significantly to a cytokine network operating to intiate, amplify and control peritoneal inflammation. In the course of peritonitis, rapid neutrophil cell influx and subsequent monocytic cell influx can be observed. Chemokines facilitate the process of leukocyte influx into the peritoneal cavity via chemotactic gradient. Using the culture system, it can be demonstrated that human peritoneal mesothelial cells secrete a C-X-C chemokine, IL-8 which contribute to the recruitment of neutrophil influx during peritoneal infection. However, the production and role of C-C chemokines have not been fully defined in human peritoneal mesothelial cells. This study was performed to evaluate the production of monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) and regulated upon activation normal T cell expressed and secreted (RANTES) and their influence on chemotactic activities of monocytes when human peritoneal mesothelial cells were stimulated with proinflammatory cytokines including interleukin-1b (IL-1b), tumor necrosis factor-a (TNF-a) or lipopolysaccharide (LPS). Mesothelial cells were obtained by enzymatic digestion of pieces of human omentum and stimulated with a various doses and incubation times of IL-1b, 10 ng/ml of TNF-a or 1.0 mg/ml of bacterial LPS. The expression of MCP-1 and RANTES mRNA was measured by Northern blot assay and the expression of their proteins was analyzed by ELISA. To evalutate their function, monocytes chemotaxis assay was performed using 48-well chemotactic chamber. The results were as follows 1. Cultured human peritoneal mesothelial cells appearred to be polygonal at confluency using phase contrast microscope. Indirect immunofluorescent staining demonstrated that the mesothelial cells reacted positively with anti-cytokeratin antibody and anti-vimentin antibody. 2. The expression of MCP-1 and RANTES increased in response to IL-1b, LPS or TNF-a. IL-1b induced the highest expression of MCP-1 mRNA and TNF-a induced the highest expression of RANTES . 3. IL-1b (1.0 ng/ml) induced the expression of MCP-1 and RANTES mRNA in time dependent manner, maximally at 3-6 hours about 8.9 and 2.3 folds respectively (n=3). 4. IL-1b induced the expression of MCP-1 and RANTES mRNA in dose dependent manner (n=2). 5. The protein levels of MCP-1 and RANTES stimulated with 1.0 ng/ml of IL-1b for 24 hours were higher than those without stimulation (30.0±2.22 vs 3.55±0.74 ng/105cells and 1.53±0.41 vs 0.11±0.02 ng/105cells respectively, p<0.05, n=6). 6. Chemotaxis assay showed that the supernatants from human peritoneal mesothelial cells stimulated with IL-1b for 24 hours had significantly higher chemotactic activities of monocytes than those without stimulation (71±3.4% vs 50±2.9%, p<0.05, n=6). Incubation of stimulated supernatants with antibodies to MCP-1 or RANTES (20 ml/ml, 10 ml/ml, respectively) resulted in an inhibition of chemotactic activities of monocytes by 33% and 12% for MCP-1 and RANTES, repectively (p<0.05). In conclusion, human peritoneal mesothelial cells are capable of the expression of MCP-1 and RANTES mRNA and the production of their proteins in response to bacteria or proinflammatory cytokines. Functionally, mesothelial cells derived MCP-1 and RANTES may contribute to the recruitment of monocytes and amplify the inflammatory process during peritoneal infection. Through these interaction, human peritoneal mesothelial cells play an important role in the pathophysiology during peritoneal infection.