냉동 보존된 생쥐 배아의 발생에 관한 연구

Abstract

최근 보조생식술에서 난소과배란 유도제의 개발과 질식초음파의 이용으로 다수의 난자와 배아를 획득하게 됨에 따라 자궁 내에 이식한 후 남은 잉여배아를 적절하게 보존하는 방법이 필수 불가결하게 되었다. 이에 따라 잉여 배아의 냉동보존이 그 해결책으로 발전되어 왔다. 배아의 냉동보존으로 얻을 수 있는 잇점은 냉동보존되었던 배아의 다음 주기 이식으로 누적 임신율을 향상시킬 수 있는 점과 과배란주기가 아닌 보다 자연적인 주기에 이식하여 배아의 착상율을 향상시키고 난소 과배란에 의한 합병증의 빈도를 줄일 수 있는 점 등이다. 그러나 냉동-해빙과정에서 배아가 손상되므로 신선한 배아에 비하여 발생율이 저하된다. 냉동보존 후 배아 발생에 영향을 미치는 인자 중에서 특히 냉동시의 배아의 발생단계에 관한 경우는 여러 연구자들의 보고가 서로 상반되어 정설이 없는 상태이다. 따라서 본 연구는 과배란 유도된 생쥐 제 1대 잡종(C57BL x CBA)의 체외수정란을 획득, 각 발생단계에서 냉동-해빙된 배아의 생존율, 발생율 및 부화율을 비교하여 어느 발생단계가 냉동-해빙 이후 배아의 손상이 가장 적은가를 규명하고자 하였고 각 발생단계에서 냉동하지않은 배아를 체외발생시켜 냉동-해빙된 배아발생과의 차이를 비교하고자 하였다. 한편 초기 발생단계의 배아에서 가장 적절한 동결보존액을 알아내고자 2-세포기, 4-세포기 배아의 경우에는 동결보존액으로 다이메칠 설포사이드(dimethyl sulfozide, 이하 DMSO로 약함)와 프로판 다이올(1,2 propanediol, 이하 PROH로 약함)을 사용하여 실험한 결과 다음과 같았다. 1.1-세포기 배아의 체외발생은 2-세포기까지 92.5%, 4-세포기는 87.5%, 상실배는 79.2%, 포배기는 70.0%의 비율로 발생하였다. 2.1-세포기 배아의 냉동보존 후 배아발생은 대조군에 비하여 유의하게 낮았다(p<0.05). 3.2-세포기 배아의 냉동보존 후 결과는 동결보존액으로 PROH나 DMSO를 사용한 경우 모두 대조군에 비하여 유의하게 낮은(p<0.05) 부화율을 보였으나, PROH와 DMSO를 비교하면 PROH를 사용한 경우가 유의하게 높은 부화율을 나타내었다(p<0.05). 4.4-세포기 배아는 PROH로 냉동보존하는 경우 대조군에 비해 낮은 부화율을 보였고(p<0.05) DMSO의 경우는 대조군과 유의한 차이가 없었다(p>0.05). 5.4-세포기 배아의 냉동보존은 동결보존액으로 DMSO를 사용한 경우가 PROH보다 부화율이 높은 경향을 보였다.(p>0.05). 6.상실배 시기의 냉동보존 후 배아발생은 부화율에 있어 대조군과 비교하여 유의한 차이가 없었다(p>0.05). 7.중기-포배기 및 팽윤-포배기에 냉동보존 후 부화율은 대조군과 비교하여 유의하게 낮은 경향을 보였다(p<0.05). 8.발생시기별로 생존율(포배기 배아의 경우 재팽윤의 비율)과 발생율을 비교하면 포배기가 다른 발생단계에 비해 유의하게 낮았다(p<0.05). 9.부화율은 2-세포기, 4-세포기 배아와 상실배가 유의하게 높았으며 이들을 체외에서 발생시켰을 경우 각각의 발생단계에 도달되는 비율로 곱하면 가장 높은 부화율의 획득은4-세포기였다(p>0.05). 이상의 결과로 보아 냉동보존하기에 이상적인 생쥐배아의 발생시기는 4-세포기 배아로 생각되며 이 시기의 동결보존액으로는 DMSO가 적합간 것으로 생각된다. 이와 같은 결과를 보조생식술을 시행하는 사람에게도 적용할 수 있을 것으로 생각하여 잉여 배아의 냉동보존 후 이식으로 현재보다 향상된 착상율과 임신율을 얻는데 도움이 될 것으로 기대된다. ; Cryopreservation has proved to be a highly successful method for long them storage of viable embryos and it is necessary for human embryo cryopreservation in assisted reproductive technology to reduce the risk of multiple gestation and severe ovarian hyperstimulation syndrome as well as contributing to an overall increase in pregnancy rates. Mouse embryo cryopreservation was carried out in order to establish the most ideal development stage of embryo for cryopreservation. F1 hybrid mouse embryo were collected according to its developmental stage; 1-cell, 2-cell, 4-cell, morula and blastocyst. 1-cell stage embryo were cryopreserved by slow cooling-rapid thawing method using PROH and DMSO. And morula and blastocyst stage embryo were cryopreserved by the same cooling method using glycerol. The frozen-thawed embryo showed significantly lower(p<0.05) hatched rate than fresh embryos. the better hatched rate was obtained when the 2-cell embryos were cryopreserved using PROH as a cryoprotectant(p<0.05). in the case of the 4-cell stage embryos, the results showed no difference in the post thaw survival rate but a better blastocystic development in the DMSO group(49.6%:38.9%)(p>0.05). the proportion of frozen embryos developing to hatched blastocysts was significantly decreased in 1-cell stage embryos and balstocysts compared to the 2-cell, 4-cell ad morula stage embryo(p<0.05). According to in vitro development of mouse embryo the highest hatching rate was obtained from 4-cell stage embryo(43.5%), so the ideal cell stage for embryo cryopreservation is 4-cell stage embryo using DMSO as a cryoprotectant.