내분비계 장애물질 선별을 위한 E-screen assay확립 및 TCDD 작용메카니즘 연구

Abstract

TCDD에 의한 CYP1A1유전자 조절 메카니즘을 알기 위하여 사람 유방암 MCF7 세포와 사람 전립선암 PC3세포를 사용하여 TCDD 투여시 발현되는CYP1A1 mRNA를 RTPCR의 방법으로 측정하였다. 에스트로겐 수용체가 다□ 존재하는 MCF7 세포에서는 TCDD 투여에 의해 CYP1A1 mRNA가 대조군의 5배 이상 증가하였으며, MCF7 세포에 비해 에스트로겐 수용체 수가 적은 PC3세포에서는 대조군의 2배 정도 증가하였다. 이들 세포에 TCDD와 에스트로겐을 병용처치할 경우 TCDD 단독투여로 증가된 CYP1A1 mRNA가 크게 감소됨이 관찰되었으며, 에스트로겐 수용체에 길항하는 tamoxifen을 투여할 경우 에스트로겐에 의해 감소된 CYP1A1 mRNA가 상당비율 회복되었다. 이로부터 에스트로겐은 에스트로겐 수용체를 경유하여 TCDD의 CYP1A1mRNA 발현작용을 억제하는 것을 알 수 있었다. Xenoestrogen으로 알려진 flavonoid 및 alkylphenol, polyphenol류 물질들이 TCDD의 CYP1A1 mRNA 발현작용에 어떤 영향올 미치는지 알기 위하여 MCF7 세포에 TCDD와 이들 물질들을 병용투여하여 발현된 CYP1A1 mRNA를 측정한 결과 에스트로겐을 투여했을 때와 유사하게 CYP1A1 mRNA 발현량이 감소하였으며, MCF7 세포에 이들 물질을 처치한 후 SRB assay를 하여 이들 물질들이 세포증식에 미치는 영향을 조사해 본 결과 대조군의 200-350% 정도의 세포증식작용이 있음이 관찰되었다. 실험결과 사용된 flavonoid 및 alkylphenol, polyphenol류 물질들이 nonylphnol>4-octyphenol>genistein>naringenin≒resveratrol>kaempferol≒daidzein 순으로 에스트로겐 유사성을 가지고 있음을 알 수 있었으며, 본 실험은 미지물질의 에스트로겐 유사성 존재 여부와 그 강도를 판단할 수 있는 E-screen assay의 방법체계로 쓰일 수 있을 것으로 사료된다. 또한 TCDD가 CYP1A1 mRNA발현을 유도하는 기전에 영향을 미치는 여러 인자들에 대해 실험해 보았다. 첫째, aryltydrocarbon receptor(AhR) 길항제인 α-naphthoflavone을 TCDD와 병용투여했을 때 TCDD에 의한 CYP1A1mRNA 발현증가는 현저하게 억제되었으며, 이로부터 TCDD가 AhR을 경유하여 CYP1A1 mRNA를 발현시킴을 알 수 있었다. 둘째, 저산소상태를 유도하는 iron chelating agents를 TCDD와 병용투여했을 때 TCDD에 의해 증가된 CYP1A1 mRNA가 크게 감소하였다. 셋째, general transcription factor인 NF κB의 유도를 억제하는 pyrrolidine dithiocarbamate를 TCDD와 병용투여하면 TCDD 단독투여보다 더 많은 CYP1A1 mRNA가 발현되며, 이로부터NF κB가 TCDD의 CYP1A1 mRNA 발현작용을 억제함을 알았다. 마지막으로 TCDD가 c-fos, egr 등의 early gene의 전사과정에 미치는 영향을 조사한 결과 early gene의 mRNA는 TCDD의 농도, 시간 의존적으로 증가하였으며, 저산소상태를 유도하는 iron chelating agents와 TCDD를 병용투여하면 TCDD 단독투여 때보다 더 많은 양의 early gene mRNA가 발현되었다. ; In order to understand the mechanism of action of dioxin, we have studied the regulation of CYPIAI gene expression in MCF7 human breast cancer cells and PC3 human prostate cancer cells. TCDD treatment showed dose dependent induction of CYPIA1 mRNA in both MCF7 and PC3 cells. The magnitude of TCDD induction on CYPIA1 mRNA was 5 fold in MCF7 cells and 2 fold in PC3 cells. Estrogen inhibited TCDD-induced CYPIA1 mRNA expression and this inhibition was recovered by tamoxifen treatment. This study demonstrated that estrogen downregulated TCDD-stimulated CYP1A1 mRNA expression via estrogen receptor mediation. And we undertook a study to examine whether several flavonoids, alkylphenols and polyphenols are estrogenic. Genistein, kaempferol, daidzein, naringenin, resveratrol, nonylphenol, 4-octylphenol are used in this study. When we investigated the effect of these chemicals on the TCDD-induced CYPIA1 mRNA expression via RTPCR, they also inhibited TCDD-induced CYP1A1 mRNA expression like estrogen. And we examined the proliferative effect of these chemicals in MCF7 cells via SRB assay. They showed 200-350% proliferative effect compared with control. From this study we concluded that these chemicals are estrogenic and we assumed that this experimental system can be used to examine whether unknown xenobiotics are estrogenic. We also have studied about various factors which can influence on the TCDD-induced CYP1A1 expression. First, we examined the effect of α-naphthoflavone, the arylhydrocarbon receptor (AhR) antagonist. TCDD -induced CYP1A1 mRNA expression was strongly inhibited by α-naphthoflavone treatment and we assumed TCDD induces CYPIA1 mRNA via AhR mediated pathway. Second, we investigated the effect of hypoxia. TODD-induced CYP1A1 mRNA expression was downregulated under hypoxic condition. Third, we examined the effect of the general transcription factor, NF κB on the regulation of CYP1A1 gene expression. When we cotreated pyrrolidine dithiocarbamate, NF κB inhibitor with TCDD, CYPIA1 mRNA level was higher than TODD alone treatment. Thus, we assumed NF k B seems to interfere the action of TCDD. TCDD seems to stimulate early gene expression, such as c-fos and egr in dose dependent manner. Hypoxia seems like to inhibit TCDD-stimulated CYPIA1 mRNA expression but strongly stimulate early gene expression. However, at this moment, we do not understand the relationship between early gene and CYP1A1 gene expression.