PC12세포의 사멸을 막는 NGF와 철 이온의 synergism에 대한 연구

Abstract

혈청이 결핍되었을 때 poly-L-lysine 기질 위에서 자란 pheochromocytoma cells (PC12)는 nerve growth factor (NGF)가 있어도 이틀 이후 서서히 죽어갔다. 이러한 세포 사멸은 이틀 이후에 poly-L-lysine 기질로부터 세포가 떨어지면서 발생하였다. NGF는 붙어 있는 세포에서는 apoptosis를 억제 했으나 떨어진 세포들에 대해서는 억제하지 못했다. 이때 첨가된 철 이온은 세포의 부착을 증가시키며 NGF의 작용을 도와 주었다. 철 이온에 의한 세포 부착과 생존 증가 현상은 다른 cations (Zn^2+, Mg^2+, Cu^2+) 에서는 보이지 않는 특이적인 현상이었다. 그러나, 철 이온의 효과는 성장인자의 종류에 관계없이 나타났고 collagen 기질이 사용된 조건에서도 나타났다. 철 이온에 의한 세포 부착 증가는 matrix metalloprotease (MMP)의 활성과는 관계없었다. 철 이온의 효과는 농도 의존적으로 나타나며 100 μM에서 최적의 효과를 보였다. 여기서 특이한 점은 배양 배지에 10 μM 이상의 FeCl_2 가 첨가되면, 갈색의 실 같은 철 침전이 형성되는데. 이러한 철 침전이 형성됨에도 불구하고 세포를 죽이지 않고 오히려 생존이 증가된다는 점이다. 철 이온의 세포 부착 및 생존 증가 효과는 이들 철 침전을 제거하거나 철 침전과 세포와의 직접적인 접촉을 차단 시키는 경우 사라졌다. 또한 poly-HEMA를 사용하여 세포가 부착을 못하게 한 후 철 침전을 발라주면 세포는 철 침전이 있는 부위에만 붙어 있으며 4일 이상 살아 있었다. 이 결과들을 통해 철 이온의 효과가 나타나기 위해서는 철 침전이 중요한 역할을 한다는 것을 알았다. 철 이온은 세포가 기질에 깔리기 시작하는 초기 1시간 안에 integrin β1의 활성을 증가시키며 세포의 부착을 촉진시켰다. 세포 내에서 NGF에 의해 발생한 신호전달 관련 분자들이 철 이온에 의해 활성된 integrin 신호 전달체계에 의해 어떻게 변화하는지 조사한 결과 철 이온에 의한 부착 증가는 초기 PC12세포의 생존에 있어 중추적인 역할을 담당하는 PI3K의 활성을 더욱 증가시켰다. 그러나 PI3K의 다음 단계에 있는 Akt의 활성은 변화 없었다. 또한, 다른 MAP Kinase는 영향 받지 않았지만 JNK의 활성은 감소되었다. 이러한 세포 내 신호전달의 변화는 4일 이후 integrin β1과 α1의 발현을 증가 시키며 더욱 더 세포의 부착을 강화 시켰다. 또한 철 이온은 세포의 부착을 증가 시킴과는 관계없이 세포 내 nitric oxide (NO)의 양을 감소시켰다. NO를 없애주는 약물인 Hemoglobin과 TmpyP에 의해 세포의 생존이 증가되므로 세포 내로 이동한 철 이온이 세포 내 NO를 없애주며 세포 생존을 증가시켰다고도 볼 수 있다. 이는 세포 내로 이동해 들어간 철 이온의 작용의 한 예로 볼 수 있겠다. 이 논문을 통해 단순한 철 이온만으로 세포 부착을 증가시켜 NGF에 의해 유도된 세포의 생존율을 더 증가시키고 뿐만 아니라 세포 내 NO의 양을 감소시키며 세포의 생존을 증가시켰음을 보였다. 그러므로 NGF에 의한 PC12 세포의 생존, 분화를 유도할 때 철 이온과 함께 처리하면 보다 효과적으로 유도할 수 있음을 제시한다. ; Delayed death of serum-starved pheochromocytoma cells (PC12) on a poly-L-lysine matrix was observed even in the presence of nerve growth factor (NGF). Cells started to detach and were dead at 2 days after plating on poly-L-lysine. In contrast to the previous reports, NGF failed to block the delayed death. However, addition of iron enhanced attachment of cells on substratum and subsequently increased cell viability. It was not observed with other cations (Zn^2+, Mg^2+ and Cu^2+). Iron- increased cell viability in a concentration dependent manner and it showed a maximum effect at 100 μM. Interestingly, in my experimental conditions, gelatinous iron precipitates were formed when FeCl_2 was added in culture media, and removal of them abolished iron-enhanced attachment and viability in PC12 cells. In addition, iron precipitates rescued the cell-to-matrix adhesion on poly-HEMA-coated dishes, implying the critical role of iron precipitates on cell adhesion. Consistently, within an hour after plating, iron increased the activity of both integrin β1 and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), an important kinase for survival. Iron also increased the expression of integrin α1 and β1, and subsequently enhanced cell adhesion at 2 days. However, matrix metalloprotease (MMP) was not involved in the iron-mediated cell survival. On the other hands, iron might also regulate cell survival through decreasing nitric oxide (NO) synthesis, since iron reduced intracellular NO level and NO scavengers increased the cell viability in the similar way. Taken together, it is likely that iron either/ both directly promotes cell-ECM (extracellular matrix) interaction or/ and indirectly reducing NO level, which results in increased cell survival. Through these mechanisms, iron is possibly involved in several physiological functions of NGF as a co-element.